Сканирование гелей

Прямое денситометрическое определение. Анализируя результаты разделения белков и нуклеиновых кислот, часто упускают из вида возможность прямого сканирования гелей с помощью спектрофотометров. Этот метод отличается быстротой, позволяет проводить в процессе электрофореза повторное сканирование гелей через определенные промежутки времени для получения данных об электрофоретической подвижности исследуемых веществ и дает возможность избежать повреждения гелей при извлечении их из трубок. Недостатки метода заключаются в том, что его чувствительность (по отношению к белкам) в 2—3 раза ниже по сравнению с методом окрашивания, а также в том, что он требует [c.267]

Для обнаружения сфокусированных в тонком слое гранулированного геля макромолекул либо проводят сканирование геля при 280 нм, либо получают реплику на бумаге [1051, 1052]. Для этого на поверхность геля накладывают лист фильтровальной бумаги, а через некоторое время, достаточное для диффузии определимого количества белка в бумагу, его снимают, высушивают и окрашивают. [c.161]

Рис. 82. Сканирование петли гистерезиса прн адсорбции воды на геле окиси

Важной особенностью при проведении зонального сканирования с прямым смешением адсорбента и раствора сцинтиллятора является необходимость вводить поправку на гашение. Одним из основных источников ошибок является разная скорость десорбции различных веществ в раствор сцинтиллятора. Эффективность счета в этом случае может меняться от пробы к пробе, и ее приходится измерять для каждого образца в отдельности. Несколько лучшие результаты дает применение тиксотропного геля, позволяющего получить суспензию адсорбента в сцинтилляторе. Для того чтобы избежать эффектов, связанных с различной растворимостью со- [c.93]

Рис. 5.4. Результаты измерения активности меченных и рибо-сомных белков методом жидкостного сцинтилляционного счета с измерением лишь тех участков геля, которые содержат активность. Незакрашенные полоски отражают величину активности по тритию (имп/мин), закрашенные — по С (имп/мин). Верхняя кривая — результат денситометрического сканирования соответствующей авторадиограммы [26],

Рис. 6-14. Рамановский спектр жидкого U, полученный при сканировании со скоростью 500 см- /мин 3 мкл пробы при возбуждении гелий-неоновым лазером при 632,8 нм. Сильный сигнал при Av=0 связан с рэлеевским рассеянием лазерного излучения [34].

Из этих исследований видно, что для разделения 23 S и 16 S РНК метод электрофореза в геле по чувствительности, разрешающей способности и скорости анализа превосходит метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или хроматографию на колонке метилированного альбумина на кизельгуре (МАК). Используя метод диск—электрофореза, после окрашивания или сканирования в УФ-свете можно обнаружить уже 1 мкг нерадиоактивной РНК, тогда как в случае метода центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или хроматографии на МАК нужны в 100 раз большие количества. Применяя капилляры или [c.246]

При 230 нм белки поглощают УФ-свет значительно сильнее, чем при 280 нм. Измерение поглощения при 230 нм, обусловленное наличием в белках пептидных связей, позволило бы получать более точные количественные данные, если бы такому сканированию не мешало собственное поглощение полиакриламидного геля. [c.182]

Для сканирования как окрашенных, так и неокрашенных полиакриламидных гелей сконструированы и имеются в продаже специальные денситометры 19, 511, 601, 998, 1389]. [c.182]

Чтобы повысить чувствительность сканирования, необходимо работать при правильно выбранной длине волны. Во многих денситометрах для этого служат светофильтры. Если имеют дело с видимым отраженным светом, то цвет светофильтра должен быть дополнительным по отношению к цвету окрашенных полос. Так, например, при сканировании электрофореграммы с синими полосами требуется желтый светофильтр, В денситометрах иных типов имеются монохроматоры, дающие возможность выбрать желаемую длину волны. Кроме того, существуют спектрофотометры, к которым можно присоединить дополнительное устройство для перемещения геля. [c.192]

Другой путь повышения чувствительности денситометра заключается в применении специальной оптической приставки, увеличивающей изображение образца и тем самым повышающей разрешение. Такое приспособление особенно полезно при сканировании полиакриламидных гелей. [c.192]

При этой процедуре получается в несколько раз больше полос, чем при двойном разрезании, и, следовательно, для обработки данных необходимо сканирование. Этот метод хорош для вставок размером 5—50 т. п. н. Размер вставки может быть оценен по сумме размеров полос (оценка затруднена в случае близкого расположения полос в геле), однако поскольку НтИ не используется для получения банка клонов, то появляются аномальные объединенные фрагменты. [c.44]

Другой путь выявления белковых зон после ИЭФ — это сканирование гелей в ультрафиолетовом или видимом свете. Наибольшей точности удается достигнуть, понвидимому, при прямом сканировании гелей в процессе ИЭФ [215]. ИЭФ проводят в кварцевой трубке, покрытой изнутри метнлцеллюлозой для предотвращения электроэндосмоса [565, 566] и присоеди- [c.157]

Дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать так же, как и рибонуклеазы. Бойд и Митчелл, [156] добавляли к акриламиду субстрат (нативную или денатурированную ДНК) перед полимеризацией геля. После электрофореза гели инкубировали и окрашивали присутствующую в них ДНК метиловым зеленым. Этот метод позволяет обнаружить 250 пг панкреатической ДНКазы. При сканировании гелей на денситометре при длине волны 260—265 нм окрашивание гелей можно не проводить [155]. [c.294]

Миро и др. [876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток НеЬа наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы. [c.379]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Результаты по изучению изозимного состава ферментов представляют в виде схем или фотографий, а также в виде денситограмм, полученных путем сканирования проявленных на активность гелей в денситометре. [c.339]

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрнчески путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно при фракциони-ровании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000-100000. [c.31]

Количественный анализ остаточных количеств октахлорсти-рола и других хлорсодержащих соединений — изомерных гептахлор, гексахлор и пентахлорстиролов, гексахлор, пентахлор, тетрахлор и трихлорбензолов и гексахлорбутадиена, со держащихся в рыбе, выловленной в Великих Озерах (Канада), осуществлен методом ГХ—МС с селективным ионным детектированием на хромато масс спектрометре фирмы Fmmgan (модель 4000) Использовалась капиллярная колонка 15 м X X 0,25 мм с SE 30 с температурой изменяющейся от 60 до 120 °С (3°С/мин) и от 120 до 250 °С (10°С/мин), скорость потока гелия 30 мл/мип, энергия ионизующих электронов 70 эВ, время сканирования полного масс спектра 1 с Содержа ние октахлорстирола в рыбе из Верхних Озер было менее [c.134]

Цифровые системы применяют также в сочетании с запоминающим изображение люминесцентным рентгеновским экраном. Последний запасает значительную светосумму и высвечивает ее при сканировании экрана лучом гелий-неонового лазера. Такой метод получил название люминесцентной цифровой рентгенофафии (рис. 10). [c.182]

После фиксации в ТХУ гели фотографируют на черно м фоне с боковым освещением. Окрашенные гели необходимо снимать в проходящем свете. Предложенный недавно метод [104] съемку в УФ-свете может найти применение для регистрации электра-фореграмм в присутствии амфолитов. Если гели сканируют на денситометре при 280 нм [105], необходимо предварительно провести контрольное измерение. При денситометрии окрашенных гелей в видимой области контрольное сканирование можно не делать. [c.327]

Несмотря на такие достоинства, есть ряд объективных и субъективных причин, ограничивающих применение спектроскопии ЭПР для исследований триплетных карбенов и нитренов. Первое,основное ограничение - метод ЭПР предъявляет жесткие требования к среде, в которой находятся парамагнитные молекулы. Чувствительность резко снижается, если образец обладает электропроводностью или большми значениями диэлектрических потерь, так как при этом энергия поглощается лишь в очень небольшом поверхностном слое. Чувствительность заметно снижается и гри повышении температуры. Предел чувствительности ЭПР больше, чем концентрация карбенов или нитренов в газовой реакции, поэтому даже такой чувствительный метод, как ЭПР, не позволяет обнаружить карбены и нитрены в жидкофазных и газофазных реакциях, а также в замороженных реакционных смесях. Для того чтобы поднять концентрацию нестабильных частиц выше предела чувствительности какого-либо метода, обычно используются две методики - создание больших мгновенных концентраций при флэш-фотоли-зе и матричная изоляция. Однако для флэш-фотолиза необходимы приборы с очень большой скоростью сканирования или с фотографической регистрацией спектра. Современные спектрометры ЭПР не удовлетворяют этому условию, так как продолжительность съемки спектра обычно не менее 30 с. Поэтому в настоящее время применяется только метод матричной изоляции [1] в твердой матрице изолируются молекулы вещества-предшественника (1-0,1%) и потом подвергаются фотолизу. Эксперименты проводятся при низких температурах (обычно при температуре жидкого азота (77 К), реже - при температуре жидкого гелия (4 К)), тан как при этом спектры остаются неизменными долгое время при понижении темпфатуры возрастает чувствительность и становятся уже линии. В таких условиях частицы в матрицах находятся в основном состоянии, либо существует равновесие между двумя близкими по энергии состояниями (триплетным и синглетным). [c.147]

Определить количество копий плазмиды в клетках трансформированного штамма можно разными методами, но все эти. методы предполагают выделение суммарной дрожжевой ДНК с последуюш,им определением соотношения плазмидной и геномной ДНК. Относительно простой способ оценить число копий высококопийной плазмиды — сравнение интенсивности окрашивания бромидом этидия рестрикционных фрагментов, соответствующих плазмидной ДНК и ДНК рибосомных повторов в суммарной геномной ДНК. Если суммарную ДНК из трансформированных дрожжей обработать рестриктазой, расщепляющей плазмиду и выщепляющей рибосомный повтор, соответствующие рестрикционные фрагменты можно визуализировать, окрашивая бромидом этидкя агарозный гель после электрофореза. В УФ-свете эти полосы отчетливо высвечиваются над фоновым свечением всех остальных окрашенных бромидом этидия гетерогенных по длине рестрикционных фрагментов. В ДНК гаплоидной дрожжевой клетки содержится приблизительно 140 копий рибосомных последовательностей, содержание же плазмидной ДНК может быть оценено количественно при помощи денситометриче-ск го сканирования фотонегативов, полученных при съемке геля. Интенсивность окрашивания нормализуют относительно длины [c.232]

Препаративное электрофоретическое разделение веществ можно проводить и на пластинах геля. Но так как слой агарового геля с толщиной больше 0,5 см невозможно достаточно эффективно охлаждать и так как при увеличении толщины ге-v я качество, разделения ухудшается, Виме [1419] рекомендует делать длинные канавки для нанесения пробы вместо увеличения толщины пластины. После электрофореза разделенные компоненты можно обнаружить либо одним из оптических методов— сканированием или фотографированием в ультрафио-чяетовом свете [1076, 1077, 1307], либо окрашиванием реплики — фильтровальной бумаги, предварительно прижатой к ге-члю [451], либо окрашиванием небольшой полооки, отрезанной от основного геля. В последнем случае полоску геля прикладывают к соответствующей прокладке, пропитанной водным раствором алцианового синего [736]. [c.66]

Выявление белков после ИЭФ. Как правило, белки выявляют теми же методами, которые применяются после обычного гель-электрофореза, а именно окрашиванием электрофореграмм специальными красителями, сканированием их в видимом ли ультрафиолетовом свете, преципитацией белков специфическими антигенами, а в случае фракций, обладающих ферментативной активностью, получением энзимограмм. [c.154]

Механические повреждения поддерживающей среды, возникающие, например, при разрезании пластин крахмального геля или при извлечении из трубок столбиков полиакриламидного геля, вызывают сильное светорассеяние, проявляющееся в образовании на денситограмме ложных пиков. Столбики геля действуют как цилиндрические линзы. Поэтому их помещают в стеклянные пробирки с уксусной кислотой и сканируют с помощью хорошо сфокусированного и узкого светового луча. Другой способ состоит в том, что гели вставляют в ячейку, изготовленную из двух параллельных стеклянных пластинок, расстояние между которыми несколько меньше, чем диаметр геля. При этом столбики геля слегка сплющиваются и на них образуются плоские поверхности. Световой луч, используемый для сканирования, должен быть немного уже плоскости геля. [c.192]

Тыква и Вотруба [1319] осуществляли сканирование высушенных гелей счетчиком с полупроводниковым детектором [1318]. Важное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет одновременно выявлять несколько радиоактивных нуклидов. При этом все последующие процедуры после разрезания и высушивания геля выполняются автоматически по заранее заданной программе. Описанный метод пригоден для определения и но не позволяет измерять Н. [c.205]

Другой способ количественного определения белков основан нэ элюции красителя из белковых зон после окрашивания и обесцвгечивания электрофореграмм в стандартных условиях. Феннер и др. [374] рашивали гели 0,5%-ным раствором кумасси яркого синего R-250 в 50%-ном водном метаноле, содержавшем 7,5% уксусной кислоты, по методу, который предложили Бикл и Траут [119]. После обесцвечивания фона окрашенные зоны вырезали и краситель экстрагировали из кусочков геля 25%-ным водный пиридином (объем/объем), встряхивая их при комнатной температуре до тех пор, пока не наступало равновесие, что определяли путем повторных измерений поглощения раствора. Пиридин смещает максимум поглощения красителя с 550 до 605 нм, поэтому измерение поглощения проводили при 605 нм. Этот метод позволяет определять белки в пределах 1 — 100 мкг. Он особенно полезен при двухмерном электрофорезе на пластинах геля, поскольку их сканирование представляет в настоящее время определенные технические трудности. [c.270]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология