Векторы для молекулярного клонирования и секвенирования

ВЕКТОРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ И СЕКВЕНИРОВАНИЯ [c.209]

Желание изложить развитие методов молекулярного клонирования небольших фрагментов ДНК и связанного с ним секвенирования ДНК, насколько это возможно, в хронологическом порядке, заставляет на время отвлечься от плазмидных векторов и рассмотреть небольшие одноцепочечные фаговые вектора, тем более, что они оказали, как будет видно из дальнейшего изложения, серьезное влияние на процесс создания последующих поколений векторов. [c.213]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Приступая к описанию плазмидных, фаговых, фагмидных и кос-мидных векторов, не лишним будет напомнить, что секвенирование ДНК в середине 1970-х годов во многом стало возможным именно после клонирования фрагментов ДНК в плазмидных векторах. К настоящему времени создано огромное количество разнообразных векторов различного назначения как для прокариотических, так и эукариотических организмов. Однако здесь будут рассмотрены только специализированные векторы, предназначенные для определения нуклеотидных последовательностей ДНК и просто векторы общего назначения, благодаря которым и осуществлялось секвенирование ДНК, когда специально предназначенных векторов еще не было разработано. Хотя, подчас, очень трудно провести грань между векторами, которые могли бы считаться векторами общего назначения и векторами, специально сконструированными с первоначальной целью секвенирования ДНК. Для секвенирования протяженных фрагментов ДНК, чьи последовательности не могли быть прочитаны в одном эксперименте, разработаны рассматриваемые в следующей главе различные стратегии, основанные, главным образом, на получении серии соответствующих субклонов в плазмидных, фаговых и фагмидных векторах. Среди плазмидных векторов для молекулярного клонирования общего назначения, включая специально сконструированные векторы для секвенирования фрагментов ДНК, можно выделить несколько поколений, характеризующихся определенными чертами. [c.209]

Появление ПЦР и широкое использование этого процесса для наработки и дальнейшего изучения интересующих исследователей фрагментов ДНК, в том числе, с помощью молекулярного клонирования и секвенирования этих фрагментов, потребовало создания специализированных векторов. Хотя эти векторы и не предназначены непосредственно для секвенирования клонированных продуктов амплификации, но тем не менее они позволяют это сделать и их выделение в отдельный раздел данной главы достаточно оправданно. Обычный подход, рассчитанный на лигирование и клонирование фрагментов ДНК с тупыми концами, показал свою крайне низкую эффективность при работе с ПЦР-фрагментами. Причиной этого является наличие у амплификатов выступающих нематричных нуклеотидов на З -концах, образующихся за счет нематричной активности Taq ДНК-полимеразы, присоединяющей по одному дополнительному нуклеотиду, которым преимущественно является остаток аденина [ lark, 1988]. [c.229]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология