Электрофоретическая элюция

Непрерывная электрофоретическая элюция. Одним из наиболее важных узлов в приборах для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле такого типа является элюционная камера, образующаяся между нижней поверхностью геля и стенками нижней части прибора. При иопользова нии подобных приборов возникают следующие трудности [c.119]

Прерывистая электрофоретическая элюция. Чтобы избавиться от разведения выделяемых фракций, некоторые исследователи предпочапают использовать метод прерывистой элюции [175, 666, 1083, 1128]. В данном случае в ходе опыта электрофорез неоднократно прерывают и элюат каждый раз удаляют. Пай-дак [958] описал очень простой прибор, предназначенный для этой цели (рис. 47). Гель получают в стеклянной трубке длиной 70 мм и диаметром 30 мм, охлаждаемой снаружи электродным буферо м. Через середину геля проходит внутренняя трубка длиной 100 мм и диаметром 5 мм, оканчивающаяся в элюционной камере, ограниченной снизу диализной мембраной. Периодически через эту трубку пипеткой отсасывают буфер, содержащий элюированные белки, а в камеру вновь заливают Схематическое изображение прибо- [c.121]

Выход белков из геля на фильтр можно значительно ускорить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пластины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это было описано для электрофоретической отмывки красителя [Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-лозный фильтр ( Millipore НА ) накладывают на гель только с одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под действием электрического поля. Весь сэндвич помещают в прибор для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см. Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (например, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в 0,7 /о-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел- [c.107]

Недавно был предложен оригинальный способ электрофоретической элюции белков одновременно из нескольких полос геля, вырезанных из пластины после препаративного электрофореза [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой пропитанного буфером сефадекса Г-25 суперфайн толщиной 2—3 мм. С интервалом в 1—1,5 см перпендикулярно длинной стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укладывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут угольные электроды и подают напряжение. Под действием электрического поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежащий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в мнк-роколонки и белки из них элюируют. [c.118]

Рис. 30. Схема электрофоретической элюции белков из геля в сефадекс [Judd, 1979]

В конструктивном отношении устройства для электрофоретической элюции выполняются как с вертикальным, так и с горизонтальным расположением геля. Простейший из вариантов с вертикальным расположением представляет собой обрезанную сверху пластиковую пипетку на 10 мл с диализным мешочком на конце. В пипетку помещают пробку из стекловолокна, на которую и выдавливают из шприца измельченный гель. Пипетку заполняют буфером и с помощью U-образной трубки соединяют с катодным резервуаром [Galibert et al., 1974]. [c.158]

В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

В упрощенном варианте электрофоретической элюции рестриктов ДНК из горизонтальной пластины агарозы в качестве сорбента используют просто фильтровальную бумагу Whatman ЗММ . Полоску такой бумаги закладывают в щель, вырезанную ti пластине рядом с окрашенной бромистым этидием полосой ДНК (со стороны анода). За полоской бумаги в эту же щель закладывают и диализную пленку. Возобновляют электрофорез ч ведут его до тех пор, пока ДНК не перейдет в бумагу, контролируя этот процесс под УФ-освещением [Gurvitz et al., 1980]. По существу, в этом случае имеет место не сорбция, а обычная электрофоретическая элюция ДНК в камеру, которая образована толстой фильтровальной бумагой, смоченной буфером. После элюции ДНК с бумаги и промывки диализной мембраны авторы получали 70%-ный выход чистой интактной ДНК. Так же можно элюировать и РНК. [c.161]

Естественно, что перенос можно ускорить наложением электрического поля в поперечном направлении — от геля к нитроцеллюлозе или ДБМ-бумаге, т. е. заменить вымывание ДНК из геля ее электрофоретической элюцией. Недавно было описано очень простое устройство для этой цели в виде разъемной рамки из плексигласа с диализной пленкой и электродами из платиновой проволоки Bittner et al., 1980]. Гель агарозы кладут на пропитанный буфером нитроцеллюлозный фильтр или ДБМ-бумагу, с обеих сторон к ним прикладывают пропитанные буфером листки фильтровальной бумаги и все это зажимают между двумя половинками рамки. Ее помещают в ванночку с тем же буфером и включают напряжение поперечного электрофореза . Напряженность электрического поля приходится регулировать в зависимости от величины фрагментов ДНК, чтобы мелкие фрагменты не проскакивали через нитроцеллюлозу или ДБМ-бумагу до того, как они успеют закрепиться на них. Очень крупные молекулы ДНК авторы рекомендуют фрагментировать после электрофореза, обрабатывая их малой концентрацией ДНКазы прямо в геле. [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология