ИЭФ в горизонтальных пластинах агарозы

ИЭФ в ГОРИЗОНТАЛЬНЫХ ПЛАСТИНАХ АГАРОЗЫ [c.42]

Затем проводят электрофорез в горизонтальной пластине геля, используя для этой цели один из приборов, описанных ранее [Остерман, 1981]. Положение геля можно фиксировать на охлаждающем столике прибора с помощью липкой ленты. Фитили электродов накладывают на гель, а полярность напряжения выбирают так, чтобы катод был со стороны лунки с препаратом. В качестве электродного обычно используют тот же буфер, что и в самом геле. При напряженности поля 10 В/см и температуре охлаждающей жидкости 10° электрофорез в геле агарозы занимает обычно 1 —2 ч. [c.136]

Переносят теплую пластину на горизонтальную поверхность и быстро выливают на нее смесь агарозы с реагентом. Если необходимо, используют линейку из твердого материала, чтобы равномерно распределить жидкость по всей поверхности пластины. Пузыри удаляют, прикасаясь к ним донышком пробирки, нли отгоняя. к краям. [c.209]

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода кристаллизацией геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы. [c.17]

Собранную и уплотненную одним из описанных способов форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-вать —в горизонтальном положении пластин. Это значительно упрощает задачу герметизации формы достаточно оклеить ее по торцам пластин водостойкой липкой лентой, [c.27]

Заливать пластину удобно открытым способом, нанося дозированный объем раствора агарозы с амфолитами из подогретой пипетки на пластмассовую подложку, установленную строго горизонтально с помощью регулируемого по уровню столика. Во избежание быстрого и неравномерного застывания агарозы между подложкой и столиком целесообразно положить теплоизолирующую прокладку. Пластина агарозы после полимеризации легко снимается с подложки. При концентрации агарозы 0,8—1% она достаточно прочна, чтобы быть в свободном состоянии перенесенной на охлаждающую плиту прибора для горизонтального элект4)офореза (рис. 13). Впрочем, фирма Pharma ia предлагает и другой вариант. Она поставляет специальные пластмассовые подложки Gel Bond , на которых путем особой обработки прочно закреплен тонкий слой агарозы. После заливки, которую фирма рекомендует осуществлять с помощью ограничительной рамки, гель агарозы прочно пристает к подложке и далее всю обработку, включая высушивание, проводят на ней. Как и при электрофорезе, пластины агарозы перед использованием для завершения полимеризации следует выдерживать на холоду во влажной камере в течение суток. [c.43]

Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы. [c.17]

В первой главе подробно описан принцип метода ИЭФ, т. е. характер миграции белков под действием электрического поля в среде с изменяющейся вдоль пути этой миграции величиной pH ( градиент pH ). Достаточно детально рассмотрен и способ образования градиента pH, в частности свойства амфоли-тов — веществ, формирующих этот градиент под действием электрического поля. Такое рассмотрение необходимо для понимания описанных ниже экспериментальных подходов и позволяет сразу же выявить некоторые уязвимые места метода, игнорирование которых может привести к артефактам. Вторая глава посвящена разбору аналитических вариантов ИЭФ, сгруппированных по типу используемых гелей горизонтальные пластины полиакриламидного геля (ПААГ), вертикально стоящие трубки ПААГ и горизонтальные пластины агарозы. В отдельную главу выделен ( вычайно плодотворный аналитический [c.3]

В упрощенном варианте электрофоретической элюции рестриктов ДНК из горизонтальной пластины агарозы в качестве сорбента используют просто фильтровальную бумагу Whatman ЗММ . Полоску такой бумаги закладывают в щель, вырезанную ti пластине рядом с окрашенной бромистым этидием полосой ДНК (со стороны анода). За полоской бумаги в эту же щель закладывают и диализную пленку. Возобновляют электрофорез ч ведут его до тех пор, пока ДНК не перейдет в бумагу, контролируя этот процесс под УФ-освещением [Gurvitz et al., 1980]. По существу, в этом случае имеет место не сорбция, а обычная электрофоретическая элюция ДНК в камеру, которая образована толстой фильтровальной бумагой, смоченной буфером. После элюции ДНК с бумаги и промывки диализной мембраны авторы получали 70%-ный выход чистой интактной ДНК. Так же можно элюировать и РНК. [c.161]

По-видимому, для препаративного электрофореза нуклеиновых кислот следует предпочесть другую систему [Polsky et al., 1978]. В этом случае разделение 35 мг рестриктазных фрагментов ДНК проводили в горизонтальной пластине агарозы сечением 45 см1 Для внесения препарата в гель и его элюции служили прямоугольные камеры, прилегающие к торцам пластины (рис. 43), Камера элюции объемом 12 мл была отделена от сле- [c.166]

Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2—4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно простое приспособление, смонтированное на столике для заливкн, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при. заливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток. [c.35]

Установку пластины геля агарозы в прибор для горизонтального электрофореза, наложение полосок фильтровальной бумаги, пропитанных электролитами, и электродов производят точно так же, как было описано для пластин ПААГ. Отметим только, что в качестве анолитов не следует использовать концентрированные растворы сильных кислот, так как они могут растворять агарозу. Фирма LKB рекомендует для этой цели 0,5 М раствор уксусной кислоты, а фирма Pharma ia —0,05 М раствор серной кислоты. В качестве католита можно употреблять [c.44]

На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена. [c.129]

На горизонтально расположенную пластинку выливают расчетный объем расплавленного 1%-ного раствора агарозы (или 2%-ного агара) в 0,05—0,075 М Na-барбитуратном буфере (pH 8,6), так чтобы образовать слой геля толщиной 1—1,5 мм. Заготовленные впрок пластины можно хранить во влажной ка- [c.134]

Для фракционирования по размерам очень высокомолекулярных ДНК с молекулярной массой до ПО млн. Север использовал гели агарозы малой концентрации (вплоть до 0,1%). Такие гели являются полужидкими по своей консистенции и могут быть использованы только в варианте горизонтального электрофореза. На стеклянной пластине сначала заливают рамку из 1,5%-ной агарозы, которую затем заполняют агарозой малой концентрации [Sewer, 1980]. В то время как скорость миграции двунитевой линейной ДНК в свободной жидкости не зависит от ее-молекулярной массы (ввиду постоянства отношения заряда к линейному размеру), электрофорез в гелях агарозы малой концентрации обнаруживает эффект значительного трения ДНК о гель. Даже для ДНК с Л1 = 2 млн. скорость миграции увеличивается в 1,5 раза при переходе от 0,57о-ной агарозы к 0,1%-ной, а для ДНК с М=25 млн. это увеличение оказывается шестикратным, причем в 0,1%-ной агарозе такая ДНК мигрирует еще вдвое медленнее, чем в свободной жидкости. [c.122]

В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология