Фракционирование нуклеиновых кислот

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.216]

III. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.171]

Последнее оказалось необходимым из-за того, что сефакрилы S-500 и S-1000, предназначенные для фракционирования нуклеиновых кислот и полисахаридов, пмеют столь крупные поры, что прокалибровать их по молекулярным массам белков не представляется возможным. [c.118]

Среди множества методов фракционирования нуклеиновых кислот отметим здесь электрофорез в гелях, высокая разрешающая способность которого позволяет получить любую ДНК или РНК в индивидуальном состоянии. [c.10]

Типы сорбентов, используемых при фракционировании нуклеиновых кислот [c.68]

Универсальным сорбентом для фракционирования нуклеиновых кислот является кизельгур, покрытый метилированным альбумином. Детальная методика его получения приведена далее 53]. [c.70]

Дополнительные рекомендации н методам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот [c.69]

Данные таблицы показывают, что для отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК тотчас после облучения большое значение имеет не только фракционирование нуклеиновых кислот, но и метод их выделения. Мы применяли метод фракционированного осаждения нуклеиновых кислот спиртом в присутствии ацетата Mg . Деполимеризация ДНК и РНК тотчас после облучения костного мозга выявляется только в том случае, если ДНК и РНК выделяли без применения додецилсульфата натрия. До- [c.48]

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать ве-нДичину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот. [c.173]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

В заключение следует сказать, что использование полиакриламидного геля для фракционирования нуклеиновых кислот и их фрагментов представляется особенно перспективным [38, 93, 360]. [c.62]

Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фракционирования белков некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное, что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицательный и значительный по величине суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляющем большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идет за счет различия размеров молекул, а. не их зарядов. [c.120]

Преимущества электрофореза в градиенте пористости (концентрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет оснований предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях может смазывать эффект торможения полос при уменьшении размера пор. [c.142]

В 70-е годы был описан целый ряд других устройств для препаративного фракционирования нуклеиновых кислот электрофорезом при вертикальном расположении геля, однако по производительности, простоте и надежности они явно уступают рассмотренным выше примерам. [c.167]

Таковы основные результаты исследований, получепные на естественных бесклеточных системах. Очевидно, возможности, представляемые такими системами, далеко не исчерпаны, однако в последние годы центр тяжести переместился па искусственные системы. Этому в значительной степени способствовало развитие техники фракционирования нуклеиновых кислот и трансляции их в различных бесклеточных системах. [c.76]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

В настоящее время при помощи хроматографии производят полное удаление солей из воды (получение дистиллированной воды без перегонки), разделение сложных смесей аминокислот и гидролизатов белков (см. рис. 56), разделение сложных смесей фосфоса-харидов, пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 57), фракционирование белков (цитохрома, рибонуклеазы, инсулина и др.), фракционирование нуклеиновых кислот и различных полимеров, отделение пепсина, трипсина, алкогольдегидрогеназы, очистку антител, выделение стрептомицина, хлортетрациклина, полимиксина и других антибиотиков, а также алкалоидов, гормонов, антигиста-минных веществ. Большой интерес представляет также терапевтическое использование ионообменных смол для регулирования состава ионной среды в желудочно-кишечном тракте и для диагностических целей. [c.116]

В последнее время для зонального ультрацентрифугирования стали применять угловые роторы, обладающие, как оказалось, некоторыми преимуществами перед роторами с подвесными стаканами. Известный недостаток угловых роторов, связанный с происходящей в них конвекцией, компенсируется применением градиента концентрации сахарозы. В работе Фламма с сотр. [12] описано применение такого ротора для разделения и фракционирования отдельных цепей ДНК при помощи изопикнического ультрацентрифугирования. Направление градиента плотности в пробирке углового ротора после его остановки изменяется на 90°, что, очевидно, эквивалентно соответствующему изменению ориентации пробирки в подвесных стаканах [13]. В угловых роторах, как правило, используются пробирки относительно большего объема, и число пробирок в угловом роторе также больше, чем в роторе с подвесным стаканом. Толщина слоя жидкости с градиентом плотности в этом случае меньше, что уменьшает время достижения равновесия. В работе [12] исследовано зональное фракционирование нуклеиновых кислот. РНК в использованных авторами этой работы условиях быстро седиментирует и оседает на стенке пробирки, в то время как ДНК хорошо разделяется в градиенте плотности. На фиг. 39 иллюстрируется улучшение разрешения за счет применения углового ротора. [c.185]

Колонка для фракционирования нуклеиновых кислот состоит из трех слоев. Нижний слой содержит примерно 2,5 мг метилированного альбумина на 1 г кизельгура, а средний слой — 0,7 мг i г кизельгура. Верхний слой кизельгура является защитным и не содержит альбумина. Суспензию, кизельгура (Hyflo Super el) в забуференном солевом растворе предварительно кипятят и затем охлаждают. [c.114]

Нигард и Холл обнаружили, что адсорбционные свойства мембрапных (( ИЛьтров из нитроцеллюлозы можно нснользовать для фракционирования нуклеиновых кислот [1]. Для этой же цели нригодна и нитроцеллюлоза, упакованная в виде колонки [2, 3]. Но сравнению с мембранными фильтра- ми колонки из нитроцеллюлозы обладают большей емкостью, и, кроме того, выход нуклеиновых кислот с колонок гораздо выше. [c.125]

Одним из самых простых и широко распространенных методов фракционирования нуклеиновых кислот и других макромолекул является центрифугирование в сахарозном градиенте. Раствор с градиентом копцентрации сахарозы служит одновременно песуш,ей и стабилизуруюш ей средой, через которую движутся макромолекулы под действием центробежной силы. 1)лагодаря наличию непрерывного градиента концентрации сахарозы возможность перемешивания компонентов при встряхивании и других механических воздействиях сводится к минимуму. Этому способствует также и довольно высокая вязкость растворов сахарозы. Поэтому прп центрифугировании в сахарозном градиепте можно добиться значительно лучшего разделения смеси, чем при центрифугировании в обычном буфере. [c.127]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с успехом применяются крахмальные, агаровые, агарозные и полиакриламидные гели, а также полиакриламидные гели, содержащие агарозу. По электрофорезу РНК [105] и ДНК [387] в крахмальном геле имеется сравнительно мало работ. Электрофорез в других поддерживающих средах дает более высокое разрешение. Ричардс и Леканиду [1086] пришли к заключению, что методом электрофореза в полиакриламидном геле можно разделить смесь полинуклеотидов, имеющих мол. массу менее 10 000 и различающихся по длине всего на один нуклеотидный остаток. Рубину [1117] удалось разделить 4S-, 5S- и 5.8S-PHK. Филлипс и Тимко [1004] описали разделение 5S-PHK на два компонента. Определяя степень разрешения, которую можно достигнуть при электрофоретическом разделении РНК, они сделали вывод, что для молекул РНК, имеющих константы седиментации между 22 и 45S, степень разрешения составляет две единицы S в случае двух параллельных проб ошибка определения будет равна 5%. При шести повторных определениях степень разрешения составляет одну единицу S даже для более мелких молекул. Эти примеры свидетельствуют о том, что методы электрофореза в гелях дают превосходное разрешение при фракционировании нуклеиновых кислот. [c.369]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

При фракционировании нуклеиновых кислот для воздействия на их плавучую плотность можно варьировать добавки соли и pH среды. Фракционирование белков в градиентах метризамяаа не очень удобно ввиду высокой вязкости необходимых для этой цели довольно концентрированных растворов метризамида (40—50% rnlV). Особенно ценен метризамид для равновесного фракционирования нуклеопротеидов, которые в его растворах Hf диссоциируют и имеют небольшую плавучую плотность. Метризамид. можно использовать в щелочной среде (pH 12), когда ДНК денатурирует, и удается, например, изучать распределение белков по комплементарным нитям молекул ДНК [Russev, Tsa-nev, 1976]. [c.272]

Среди других перспективных методов фракционирования нуклеиновых кислот заслуживают внимания методы хроматографии на белковых адсорбентах (4] к на бензоиди-рованной-наф той лированной ДЭАЭ-целлюлозе [721]. [c.185]

Фракционирование нуклеиновых кислот. В 1965 г. Ричардс с сотр. [686] предложили метод электрофореза в но лдакриламидном теле для фракционирования клеточных рибонуклеиновых кислот, а затем Бишоп с сотр. [204 использовали этот метод для фракционирования вирусных нуклеиновых кислот. [c.187]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология