Белки выявление после электрофорез

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Гораздо более эффективным методом обесцвечивания является электродиализ. Этот метод используется для быстрого выявления зон с высокой концентрацией белка. Для проведения электролиза достаточно простого нестабилизованного источника постоянного напряжения. Требуемый ток зависит от направления электродиализа в геле. С помощью электродных сосудов и источника питания, аналогичных применяемым при дискретном электрофорезе, удается осуществить более длительный и более сложный продольный электродиализ. Гели, имеющие форму круглых столбиков, помещают в трубки, диаметр которых лишь немного больше диаметров столбиков. В нижней части трубки сужаются, так что гель образует затвор. Электродные камеры и трубки с гелем заполняют 7%-ной уксусной кислотой. После включения тока за процессом обесцвечивания можно наблюдать визуально. Наиболее быстрым методом обесцвечивания является электродиализ в направлении, перпендикулярном длинной оси геля. Для проведения обесцвечивания разработаны специальные приборы, выпускаемые рядом фирм. В маленьком приборе конструкции Прусика [78] обесцвечивание можно провести за 30—45 мин. Этот прибор (рис. 12.10) можно легко изготовить в любой лаборатории. [c.309]

Для выявления области геля, содержащей гибридный белок, после электрофореза вымочите гель в охлажденном 0,1 М КС1. Холодный раствор, содержащий ионы К+, преципитируют ДСН в дорожках геля, в результате чего появляются соответствующие фракционированным белкам белые полосы. Такую полосу, соответствующую гибридному белку, можно вырезать из геля острой бритвой. Это устраняет необходимость фиксации и окраски кумасси полосы геля с исследуемым белком или параллельных дорожек геля. [c.157]

Рис. 4-50. Анализ образнов белка методом электрофореза в ДСП-полиакриламидном геле. Па фотографии показан гель, использованный для выявления белков, присутствующих на последующих стадиях очистки фермента. Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную смесь белков исходного клеточного экстракта, каждая из последующих дорожек содержит белки, полученные после хроматографического фракционирования белковых образцов, анализированных на предыдущей дорожке (см. рис. 4-47). В лунку каждой дорожки на гель наносили одинаковое количество белка (10 мкг). Отдельные белки в норме проявляются в виде узких окрашенных полос полосы расширяются, если в них присутствует слишком много белка. (С любезного разрешения Tim

Для выявления нейрофизинов после электрофореза в полиакриламидном геле предложен метод [880], в основе которого лежит реакция с фуксиновым альдегидом. Метод, по-видимому, специфичен для белков с высоким содержанием цистеина. [c.276]

Природные субстраты протеаз также пригодны для выявления этих ферментов после электрофореза. Гели инкубируют с белками, а затем окрашивают и обесцвечивают обычными для белков методами. Бесцветные или слабо окрашенные полосы появляются в местах действия протеолитических ферментов. Во многих случаях применяют окрашенные белки, что позволяет избежать трудоемких процедур окрашивания и обесцвечивания. [c.303]

Для обнаружения рибосомных белков после электрофореза можно использовать любой применяемый после электрофореза в геле метод выявления белков (например, окрашивание амидовым черным 10 В, кумасси ярким синим К-250 или 0-250, а в случае радиоактивных белков -радиоавтографию). Недавно [c.314]

При механической желтухе в плазме больных обнаруживается особый липопротеид (Lp-X), который по своей плотности принадлежит к ЛНП и обладает характерным липидным и белковым составом. Выявление Lp-X на электрофореграмме основано на его миграции к катоду при обычных условиях электрофореза в агаровом геле. Для увеличения катодной подвижности Lp-X пластины агарового геля необходимо выдерживать перед электрофорезом не менее 6 ч [990, 1166]. Надежная локализация этого белка стала возможной благодаря применению специфических антисывороток [1164]. Петек и др. [990] сравнили три различных способа проведения иммунопреципитации. При первом способе антисыворотку помещают в канавки, подобно тому как это делается при иммуноэлектрофорезе по методу Шайдеггера. Во втором способе после электрофореза в геле вырезают круглые лунки для антител на расстоянии 4 мм от лунок для антигена. В обоих случаях время, необходимое для диффузии, составляет 12—16 ч. Второй способ является более экономным с точки зрения расходования антисыворотки. При использовании третьего способа (иммунофиксация) антисыворотку прямо наносят на поверхность геля на расстоянии [c.355]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Один из способов идентификации нужного фермента среди многих компонентов, разделившихся в процессе электрофореза, состоит в специфическом окрашивании этого фермента. Естественно, такой способ можно применять только в тех случаях, когда электрофорез проводят в неденатурирующих условиях и, следовательно, он не пригоден для выявления ферментов после электрофореза в присутствии мочевины или ДСН. Кроме того, процедуру идентификации фермента следует проводить без предварительной фиксации белковых полос, и тем не менее используемые реагенты должны успеть продиффундировать в гель прежде, чем произойдет диффузия самого фермента. Наиболее удовлетворительные результаты дают те методы, в которых гель разрезается по толщине на тонкие пластины (рис. 9.6), благодаря чему полосы белков оказываются на поверхности и необходимость в длительной диффузии реагентов в гель отпадает. Лучше всего для этого подходят крахмальные или полиакриламидные (толстые) пластины после проведения простого гель-электрофореза, электрофореза в градиентных гелях н изоэлектрического фокусирования. [c.327]

Выявление белков после ИЭФ. Как правило, белки выявляют теми же методами, которые применяются после обычного гель-электрофореза, а именно окрашиванием электрофореграмм специальными красителями, сканированием их в видимом ли ультрафиолетовом свете, преципитацией белков специфическими антигенами, а в случае фракций, обладающих ферментативной активностью, получением энзимограмм. [c.154]

Другой подход — это выявление в ядерных экстрактах белков, способных специфически связываться с определенными участками ДНК. Для этого экстракты, выделяемые обычно из ядер с помощью 0,2—0,4 М солевых растворов, инкубируют с клонированными фрагментами меченой ДНК в присутствии избытка немеченой неспецифической ДНК (например, из Е. oli). Комплексы ДНК с белками выявляют либо путем их сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах, либо наблюдая замедление миграции данного, фрагмента при гель-электрофорезе. Зная рестриктный фрагмент, с которым специфически взаимодействуют белки ядерного экстракта, можно далее выявить участки этого фрагмента, защищаемые связанным белком от атаки нуклеазами (ДНКазой I, экзонуклеазой) или химическими агентами (например, диметилсульфатом). Для этого после мягкой обработки расщепляющими агентами фрагменты ДНК (меченные предварительно по одному концу) разделяют с помощью электрофореза в геле вместе с обработанными тем же методом препаратами свободной ДНК. Сравнивая полученные наборы продуктов расщепления, легко определить участки ДНК, защищаемые белком с точностью до одного нуклеотида (рис, 31), [c.168]

Электрофорез используется для разделения молекул, несущих суммарный заряд. Низковольтный электрофорез на бумаге нашел широкое применение для разделения аминокислот, пептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и заряженных производных углеводов. Однако при низковольтном электрофорезе на бумаге имеет место значительная диффузия малых молекул, поэтому для их разделения применяют, как правило, высоковольтный электрофорез, при котором время разделения сводится до минимума и вследствие этого уменьшается диффузия. Вместо бумаги в качестве носителя зачастую используют ацетат целлюлозы, высокая чистота которого обусловливает уменьшение адсорбции образца, а следовательно, и лучшее разделение его компонентов. Одним из преимуществ ацетата целлюлозы является также его слабое фоновое окрашивание, что облегчает выявление соединений после рааделе-ния. Электрофорез на ацетате целлюлозы нашел широкое применение в клинике для разделения белков сыворотки крови (включая гликопротеиды и липопротеиды) и гемоглобинов он применяется также при иммуноэлектрофорезе. Высоковольтный электрофорез, как бумажный, так и тонкослойный, используется для разделения аминокислот, концентрация которых в плазме крови и моче при различных нарушениях обмена может быть довольно высокой. Особенно велика ценность тонкослойного электрофореза при разделении малых молекул, таких, как аминокислоты и нуклеотиды, поскольку [c.136]

На этом этапе были сделаны два наблюдения, которые открыли совершенно новые подходы. Одним из них было обнаружение Керром и сотр. [124, 125] ингибитора трансляции в экстрактах из обработанных интерфероном клеток и его идентификация как 2,5-oligo(A) другим было выявление фосфорилиро-вания по крайней мере двух белков только в обработанных интерфероном клетках. В обоих случаях интерферон индуцировал синтез ферментов, которые полностью отсутствовали в необработанных клетках. Тот факт, что интерферон индуцирует антивирусное состояние только в том случае, если разрешен синтез мРНК и белков, конечно, был известен давно предпринимались попытки идентифицировать эти белки при помощи одно-или двумерного электрофореза [88, 201]. Однако, хотя было показано, что после обработки интерфероном образуется несколько новых полипептидов, ни один из них не удалось идентифицировать. Таким образом, под действием интерферона возникают две новые ферментативные активности. [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология