Конструирование космидных библиотек

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Конструирование космидных библиотек [c.86]

III. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОСМИДНЫХ БИБЛИОТЕК [c.18]

В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]

Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на основе векторных фагов Я (см. табл. 2.1). Однако последние все же предпочтительнее в тех случаях, когда не требуются фрагменты размером более 20 тпн. Это связано с некоторыми техническими сложностями, возникающими при конструирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лигирование векторов друг с другом (см. рис. 2.20), что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скрининг большого числа колоний бактерий проводить сложнее, чем фаговых бляшек. Клонированные крупные фрагменты в составе ДНК фага более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию молекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фрагментов необходимо проводить фракционирование клонируемой ДНК или дефосфорилирова-ние, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология