Градиентное центрифугирование

В препаративных опытах. Необходимо учитывать также возможные изменения плотности среды. Однако плотность в меньшей мере зависит от температуры, чем вязкость. Ниже мы укажем и на другие параметры, которыми препаративный опыт может отличаться от аналитического, но в первую очередь необходим оптимальный учет изменений плотности и вязкости среды. Эти величины легко определить или найти из таблиц. Такого рода таблицы сведены вместе в прекрасном обзоре де Дюве и сотр. [4], посвященном градиентному центрифугированию клеточных компонентов. В значительной мере благодаря этому обзору препаративное ультрацентрифугирование перестало быть искусством и стало точной дисциплиной. В табл. 4 приведена часть данных из обзора де Дюве [4], позволяющих в сочетании с уравнение (IX. 3) учитывать эффекты, которые могут возникнуть при переходе от обычного буферного раствора к раствору с сахарозой при той или иной температуре. [c.175]

Метод градиентного центрифугирования [c.62]

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Очистку РНК можно производить различными методами, в том числе хроматографией на колонке, нротивоточным распределением и градиентным центрифугированием. [c.41]

Три основные фракции РНК можно легко разделить путем градиентного центрифугирования в растворе сахарозы [17]. Пробирки ультрацентрифуги наполняют раствором сахарозы возрастающих концентраций — от 5% наверху до 20% внизу. Раствор РНК осторожно наносят сверху и центрифугируют с большой скоростью в течение нескольких часов. Затем дно пробирки про- [c.41]

Применение градиентного центрифугирования и колонок из ДНК-агара для обнаружения и выделения т-РНК описано в в гл. ХП. [c.42]

Наиболее надежные результаты были получены для s-PHK, константа седиментации которой при градиентном центрифугировании равна 4 S. Молекулярный вес этой РНК составляет от 23 ООО до 28 ООО [18]. Близкие значения были получены в результате химических определений молекулярного веса, основанных на анализе концевых групп. [c.54]

С помощью градиентного центрифугирования РНК, выделенной из клетки после периода вытеснения метки, удалось показать. [c.242]

Очистка вирусов градиентным центрифугированием [c.100]

В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки штамма А2 [25]. [c.150]

Очищенные методом градиентного центрифугирования вирионы (см. разд. 3.5) осаждают центрифугированием через слой 30%-ного раствора сахарозы в буфере NTE при 50 000 g 60 мин. Осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 10% (объем на объем) тритона Х-100. [c.156]

Чтобы пометить вирусную РНК [ Н]-уридином, клетки инкубируют в течение ночи со средой без сыворотки, заражают по стандартной методике, затем добавляют 0,1 мКи/мл [ Н]-ури-дина в той же среде. Содержащую вирус среду собирают через 24 ч после заражения. Если в используемых клетках вирус размножается до высокого титра, то при очистке градиентным центрифугированием вирус, полученный, например, с одной чашки диаметром 10 см, в градиенте объемом 12 мл должен образовать видимую простым глазом зону. Если же выход вируса низок, в параллельном градиенте центрифугируют большее количество немеченого вируса и отбирают из градиента, содержащего радиоактивный материал, соответствующие фракции. Иногда раскапывают весь градиент и определяют радиоактивность в каждой фракции. [c.195]

В результате первого градиентного центрифугирования получают осадок, содержащий большое количество вируса. Осадок можно ресуспендировать и дополнительно очистить вторым градиентным центрифугированием. Фракции очищенного вируса могут быть использованы для определения концентрации белка, [c.301]

Для фракций, полученных с хроматографической колонки или после градиентного центрифугирования, проблемы отмывки предшественников не существует. Препараты на фильтрах достаточно осадить однократной обработкой ТХУ, а затем только удалить воду с помощью этанола и эфира. [c.215]

В настоящее время существует несколько модификаций метода градиентного центрифугирования, основанного на разделении частиц по скорости седиментации или плотности в среде, где отсутствует конвекция жидкости. Они отличаются в основном в следующем в материале, применяемом для образования градиента, в способах формирования самого градиента и в скорости вращения ротора и продолжительности центрифугирования. [c.59]

Несмотря на это, все методы градиентного центрифугирования можно разделить на три группы в зависимости от используемого градиента [219] [c.59]

Применяя метод осаждения на градиентную интерфазу, не всегда достигается высокая степень очистки для вируса. Поэтому после подобной процедуры проводят градиентное центрифугирование в хлористом цезии или сахарозе. [c.69]

Применение радиоактивных предшествошиков полисахаридов позволяет обнаружить место синтеза ГМЦ в клетке. Это можно проиллюстрировать на результатах следующего эксперимента [43]. Корешки проростков гороха помещали на 40 мин. при 20°С в раствор С б-глюкозы. Затем корешки отрезали, измельчали, удаляли растворимые соединения и путем градиентного центрифугирования выделяли фракцию митохондрий и фракцию телец Гольджи [21]. Полученные фракции подвергали кислотному гидролизу, проводили анализ сахаров и определяли их радиоактивность. Большая часть активности гидролизата телец Гольджи обнаружена в галактозе, затем в порядке уменьшения — в ара-бинозе, глюкозе, ксилозе, маннозе. Это показывает, что в тельцах Гольджи происходит активный синтез пектиновых веществ и гемицеллюлоз, ио не синтезируется целлюлоза. [c.26]

Получены четкие доказательства (см. стр. 161 и 250) того, что репликация РНК вирусов сопровождается образованием дв х-ценочечной репликативной формы РНК. В качестве примера можно назвать репликативную форму РНК, образующуюся нри действии РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-синтетазы) в клетках Е. oli, инфицированных РНК бактериофага MS2 (стр. 250). Эта РНК устойчива к рибонуклеазе, но нри нагревании до высоких температур (от 102 до 104°) наступают резкие изменения. При быстром охлаждении образуется чувствительное к действию рибонуклеазы вещество устойчивость к рибонуклеазе восстанавливается, если это вещество охладить до температуры ниже ее температуры плавления [79—84, 94]. При градиентном центрифугировании двухцепочечная форма характеризуется несколько меньшей плотностью, чем соответствующая одноценочечная. [c.59]

Разделение нативной и денатурированной ДНК осуществляется также при помощи метода противоточного распределения [8, 17] и при помощи нитроцеллюдозных мембран [18, 31]. Очистка и выделение ДНК с применением градиентного центрифугирования описаны ниже (стр. 6-5). [c.64]

Если, подействовав на вирус желтой мозаики турнепса щелочью, расщепить его РНК на отрезки 58 (см. разд. IV.А) и затем выделить РНК (в отсутствие ЭДТА), то при градиентном центрифугировании выделенная РНК будет вести себя как единая быстроседимептирующая фракция. Объясняется это, очевидно, тем, что 32 фрагмента, образовавшихся под действием щелочи, реагреги-ровали внутри вируса в форму, более компактную, чем у интактной РНК того же вируса [45, 258]. Это наблюдение наряду с результатами, полученными для крупных молекул РНК вирусов гриппа и саркомы Рауса (см. ниже), указывает на необходимость более критического подхода к оценке седиментационных данных. [c.113]

Метаболически активные ядра могут быть получены также путем градиентного центрифугирования в растворах сахарозы, декстрана [156] или фиколля (высокомолекулярный полимер сахарозы) [157]. [c.137]

Для размножения вирусов in vivo обычно проводится непрямая инокуляция личинок путем загрязнения корма оптимальной дозой вируса в оптимальное время (фаза развития). Затем личинок инкубируют до накопления достаточного титра вируса, их трупы гомогенизируют и сырой продукт фракционируют градиентным центрифугированием. Фракцию вирусов (вирионов или белковых включений) консервируют в глицерине, хранят в виде буферного раствора при глубоком замораживании или лиофилизируют с добавлением защитных коллоидов белковые включения можно также подвергать распылительной сушке. [c.151]

Зонное центрифугирование при условии, что плотность вблизи дна кюветы выше, чем плотность любого из компонентов образца, было названо Андерсоном [51 изопикническим градиентным центрифугированием . В эксперименте этого типа ни один из компонентов не достигает дна ячейки, как бы долго ни продолжалось центрифугирование. Чрезвычайно удобный для такого рода препаративной работы ротор был описан Андерсоном [61. Он представляет собой полый цилиндр, разделенный на 36 секторов. [c.418]

В принципе экспериментатор может приготовить сахарозные градпеи-ты почти с любым характером изменения концентрации. Бок и Линг [1] описали устройства для пригоговлепия линейного, вогнутого н выпуклого градиентов. Бриттен и Робертс [2] в своем фундаментальном псследоваппи, посвященном теории и практике градиентного центрифугирования, осо- [c.127]

Более тонкие методы седиментационно-диффузионного равновесия недавно развиты Шолте [186], который применил метод концентра-ционно-градиентного центрифугирования Фуджита. Этот метод позволяет вычислить четыре средних молеку тярных веса — Ai , Мц., я т. е. МВР определяется с приемлемой степенью точности. [c.39]

С получением таких данных стало очевидно, что можно понять природу процесса репликации, ответственного за синтез ДНК — предшественника фага, проследив за судьбой молекулы родительской ДНК, инъецированной в клетку-хозяина инфицирующим фагом. В частности, интересно было установить, действительно ли при репликации атомы родительской молекулы распределяются полуконсервативным способом, в соответствии с механизмом, постулированным Уотсоном и Криком. Первые опыты такого рода, подобно опытам при изучении бактериальной ДНК, включали метод по переносу с использованием радиоактивных изотопов или С), и они не дали определенных результатов. Однако вскоре после того, как Меселсон и Сталь исследовали распределение ДНК по плотности методом градиентного центрифугирования, этот метод стали использовать для изучения репликации ДНК Т-четных фагов. [c.268]

Как ясно видно из фиг. 177, плотность трансдуцирующих и инфекционных частиц, образовавшихся в равномерно меченной тимином легкой культуре А, не в точности совпадает и, следовательно, эти частицы можно разделить по плотности с помощью метода градиентного центрифугирования в s l. Таким образом, можно определить, какая доля частиц фага Р1 в лизате обладает трансдуцирующей активностью. Для этого ДНК бактерий-доноров метили Н, выращивая культуру на среде с Н-тими-дином. Затем культуру переносили на среду с нерадиоактивным тимиди-ном и Ф0 , так что ДНК, синтезированная после этого переноса, содержала метку Наконец, культуру заражали фагом Р1 и образовавшийся фаголизат фракционировали центрифугированием в градиенте плотности s l. Эти опыты показали, что количество меченной Н ДНК во фракции частиц, способных осуществлять трансдукцию маркера Leu+ донора, составляет 0,3% общего количества меченной Р ДНК, входящей в состав всех фаговых частиц, подвергнутых фракционированию. Следо- [c.356]

С этой точки зрения даже наиболее высокоочищенные препараты вирусов можно рассматривать как статистически гомогенные лишь в первом приближении. Тем не менее, прежде чем использовать препарат вируса для физико-химических, биохимических или биологических экспериментов, важно установить, по возможности более тщательно, степень этой гомогенности или гетерогенности. Большинство методов очистки вирусов можно использовать также и для определения гомогенности вируса. Если при равделении в градиенте концентраций сахарозы вирус образует одну-едииственную резко ограниченную полосу, можно считать, что по седиментационным свойствам исследуемый препарат более или менее гомогенен. Однако если очистку вируса проводят только путем повторных циклов градиентного центрифугирования в растворе сахарозы, каждый раз удаляя материал, седиментирующий быстрее или медленнее, чем вирус, то в этом случае равномерность скорости седиментации уже не может служить показателем гомогенности. Иными словами, только сочетая при очистке и (или) проверке на гомогенность самые разнообразные методы, основанные на разных принципах, можно быть уверенным, что мы действительно имеем дело с каким-то определенным типом гомогенных частиц. К таким разнообразным критериям относятся константа седиментации, [c.47]

В зрелой плазматической клетке, синтезирующей иммуноглобулины определенного класса (изотипа), существует два вида полирибосом одни — с мРНК для легких цепей, а другие — для тяжелых. Их скорость седиментации составляет 200S и 300S соответственно и позволяет разделить их с помощью градиентного центрифугирования. Полирибосомы для легких цепей состоят из 4—5, а для тяжелых цепей — из 11—18 рибосом. Время трансляции составляет для легкой цепи 1 мин, а для тяжелой — 2 мин. [c.120]

С помощью иммуносорбента для антигена могут решаться задачи, имеющие существенное значение для молекулярной биологии. Приведем в качестве примера выделение на иммуносорбенте типа сэндвич полирибосом, синтезирующих легкие полипептидные цепи (Е. Сидорова и др., 1978). Сорбент был нагружен антителами против легких цепей иммуноглобулинов мыши. Выделенные из клеток мышиной плазмацитомы полирибосомы для легких цепей (использовали технику градиентного центрифугирования) содержали растущие легкие цепи. Как следует из этой и других работ, растущие полипептидные цепи уже имеют, ио крайней мере, часть антигенных детерминант, характерных для данной полипептидной цепи, поэтому растущая цепь избирательно связывается с иммобилизованными антителами против этой цепи, а вместе с ней связываются с иммуносорбентом полирибосомы, содержащие мРНК для легких цепей. Теперь остается промыть иммуносорбент, путем фенольной экстракции выделить РИК и очистить мРНК общепринятым способом. Описанный принцип или аналогичные методы извлечения мРНК позволяют получить препараты определенной информационной нуклеиновой кислоты свыше 90% чистоты. [c.243]

Разрушение клеток вызывает фрагментацию мембран и образование пузырьков (везикул) разного размера и плавучей плотности. Для выделения и разделения мембран ЦС используют методы дифференциального и градиентного центрифугирования и их сочетание. Метод дифференциального центрифугирования позволяет отделить мембранные пузырьки от других субклеточных структур, отличающихся по массе, следовательно, и по скорости седиментации. Таким методом можно получить тотальный препарат мембран (мнкросомную фракцию), содержащий мембраны НЦС и ЗЦС. Метод градиентного центрифугирования, позволяющий разделять структуры по плавучей плотности, используют для получения НЦС и ЗЦС. Сочетанием этих методов можно увеличить чистоту препаратов и выход материала мембран. [c.330]

Равновесным градиентным центрифугированием в три этапа удалось разделить сателлитные ДНК из тимуса с плавучими плотностями (в s l) 1,706 1,715 и 1,723 г/см . На первом этапе использовали центрифугирование в градиенте OS2SO4 с участием БАМД, на втором — с участием ионов Ag . На третьем [c.266]

Счет радиоактивности в случае радиоактивно меченных нуклеиновых кислот. Для этого вещество осаждают обычно такой кислотой, как трихлоруксусная, и затем отфильтровывают. В случае нуклеиновой кислоты, меченной тритием, особенно при низком уровне радиоактивности, фильтрацию следует проводить очень тщательно. Этот вопрос подробно рассматривают Шрайер и Вильсон [184], которые рекомендуют использовать не мембраны, а фильтры из стекловолокна. Речь идет о выполненных из сверхтонкого волокна фильтрах типа ОР/Р фирмы Ватман (номинальный размер пор 0,7 мкм), которые прекрасно задерживают очень мелкие частицы. Применение этих фильтров может потребовать солюбилизации радиоактивных веществ, но для большинства приложений счет оказывается удовлетворительным, а также более удобным и без солюбилизации. Для счета малых образцов необязательно фильтровать образец под вакуумом. Вместо этого каждый образец прикладывают к дисковому фильтру, после чего реакцию прерывают, погружая фильтр в холодную трихлоруксусную кислоту. При этом макромолеку-лярный продукт осаждается равномерно по всей поверхности фильтра, который затем может быть промыт декантацией. После этого фильтры сушат на воздухе и производят счет. При работе с большим количеством образцов, таких, как фракции, получаемые при колоночной хроматографии или градиентном центрифугировании, можно использовать стекловолоконные фильтры в виде полос, причем фракции наносят прямо на фильтр, кото- [c.318]

Концентрировать многие миксовирусы при помощи сульфата аммония нельзя, так как наступает деструкция вирусной частицы. Для этой цели иногда используют метанол. Для большинства миксовирусов наиболее удобным предварительным методом концентрирования и очистки является метод адсорбции — элюции на формалинизиро-вапньтх эритроцитах или на некоторых неорганических сорбентах. Широко пснользуется дифференциальное центрифугирование. Самое широкое распространение для очистки и фракционирования миксовирусов получил метод ионообменной хроматографии. Метод равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия не всегда применим при очистке некоторых миксовирусов. Поэтому используют градиентное центрифугирование в сахарозе, тартрате и цитрате калия. [c.9]

Вследствие очень высокой лабильнбсти вирусов этой группы очистку производят при помощи дифференциального и градиентного центрифугирования в сахарозе, цитрате калия или фиколле. Иногда применяют хроматографию на гидрокснлапатиге. [c.10]

В заключение следует сказать, что методы градиентного центрифугирования наиболее совершенны из всех известных в настоящее время методов очистки вирусов. Причем для некоторых вирусов достигается абсолютная очистка. Относительная сложность методов градиентного центрифугирования не препятствует его широкому распространению в препаративной биохимии вирусов. Единственным ограничением пока является то, что очи щать мoяiнo лишь сравнительно небольшие объемы вирус-содержащего материала. Поэтому для увеличения выхода очищенного вируса желательна его предварительная концентрация. Но в последнее время разрабатываются методы препаративного фракционирования в равновесном и в зональном градиенте. Для препаративных целей стали использовать угловые роторы, объем которых значительно больше объема горизонтальных [319, 324], что делают этот [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология