Рестрицирующие эндонуклеаз сайты узнавания

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа Пив которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием линюгх концов, существуют рестрик-тазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тет-ра- и гексануклеотиды. [c.53]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология