Рестрицирующие эндонуклеаз

С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные биологические фабрики по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин. [c.179]

Рис. 4.1. Клонирование рекомбинантной ДНК. Донор-ную ДНК расщепляют рестрицирующей эндонуклеазой и встраивают в клонирующий вектор. Полученную конструкцию вводят в попу ляцию клеток-хозяев, идентифицируют те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК, и культивируют их. При необходимости можно индуцировать экспрессию клонированного гена в клет-ках-хозяевах и получить кодируемый им белок.

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. . Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 9.7. Использование Саузерн-гибридизации для судебной экспертизы. ДНК, вьщеленная из крови пострадавшего, из пятна крови на рубашке подозреваемого и из его крови была обработана одной и той же рестрицирующей эндонуклеазой. Лестница фрагментов для ДНК, вьщеленной из пятна крови на рубашке, идентична таковой для ДНК пострадавшего и отличается от лестницы фрагментов для ДНК подозреваемого.

Выделена первая рестрицирующая эндонуклеаза [c.18]

Рестрицирующие эндонуклеазы типа И играют ключевую роль при генном клонировании. [c.53]

Рис. 4.5. Отжиг комплементарных липких концов фрагментов, образующихся при расщеплении двух разных образцов ДНК рестрицирующей эндонуклеазой Ват . Четыре фрагмента, представленных на рисунке, могут соединиться друг с другом с образованием щести разных молекул ДНК (на рисунке показаны не все возможные комбинации). Фрагменты удерживаются вместе водородными связями, образующимися между четырьмя основаниями липких концов, но эти связи недостаточно прочны, чтобы молекулы в растворе оставались стабильными длительное время.

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа Пив которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием линюгх концов, существуют рестрик-тазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тет-ра- и гексануклеотиды. [c.53]

Рис. 4.10. Частичный гидролиз фрагмента ДНК рестрицирующей эндонуклеазой типа П. Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке, расщеплены по всем сайтам для рестрицирующей эндонуклеазы 1 (КЕ1-сайтам), другие только по некоторым.

Расщепление рестрицирующими эндонуклеазами имеет еще одно применение. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов -рекомбинантные ДНК (рис. 4.5). [c.55]

Рис. 6.1. Идентификация сильных регулируемых промоторов. В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хромосомную ДНК разрезают рестрицирующей эндонуклеазой Abel и встраивают фрагменты в плазмиду. Если ген-репортер эффективно экспрессируется, значит, клонированный фрагмент содержит функциональный промотор.

Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адапторов — коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном. При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется рестрицирующая эндонуклеаза Aval кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали Aval- и соШ-сайты. [c.118]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Рис. 10.1. Структура генов ИФа.2, ИФаз и четырех гибридных генов. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ИФа и ИФаз обнаруживает наличие у них одинаковых сайтов для рестрицирующих эндонуклеаз (RE1, RE2, RE3). Рестрикция по этим сайтам и лигирование полученных фрагментов приводят к образованию раз-личньЕх гибридных генов. В нижней части рисунка представлены четыре из них.

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Плазмиду, которая содержала сегмент ДНК, кодирующий Aj-пептид, обработали рестрицирующими эндонуклеазами С1а и ХЬа, каждая из которых расщепляла только кодирующую Aj-пептид последовательность вставки. [c.236]

При наличии эффективной системы экспрессии получение белка - продукта специфического гена - не составляет особого труда. Белок может представлять собой либо тот конечный продукт, который хотят получить (например, рестрицирующую эндонуклеазу), либо фермент, катализирующий определенную химическую реакцию (например, одну из реакций биосинтеза антибиотиков). Иногда в результате генетических манипуляций микроорганизм приобретает способность к синтезу нового фермента и может использоваться для получения in vivo низкомолекулярных соединений - витаминов, аминокислот, красителей, антибиотиков, предшественников различных биополимеров и т. д. Такой микроорганизм становится фабрикой по производству полезных метаболитов. [c.247]

Адаптер (Adaptor) 1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким. После пришивания адагггора тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец. 2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для рестрицирующей эндонуклеазы. Когда адаптор встраивают в клонирующий вектор, у последнего появляется новый сайт рестрикции. [c.543]

Палиндром (Palindrome) Участок двухцепочечной молекулы ДНК, обе цепи которого обладают одинаковой нуклеотидной последовательностью при про-читывании от 5 - к 3 - концу. Такие участки часто распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа П. [c.555]

Эндонуклеаза (Endonu lease) Фермент, гидролизую-ший внутренние фосфодиэфирные связи и расщепляющий молекулы ДНК и РНК. Эндонуклеазы участвуют в рекомбинации, репарации и рестрикции в последнем случае называются рестриктазами (рестрицирующими эндонуклеазами). [c.565]

Рис. 36.2. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами (рестриктазами). В результате рестрикции образуются

II и III. Все рестриктазы узнают на дв)спиральной ДНК строго определенные нуклеотидные последовательности. Однако рестриктазы класса I осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы классов II и III узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнава-нмя или на фиксированном от них расстоянии. Ферменты типов 1 и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей — модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Ферменты И-го класса состоят из двух отдельных белков рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В силу указанных причин в генной инженерии используют исключительно рестриктазы класса II. [c.139]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология