Клонирование с помощью рекомбинации

Клонирование с помощью рекомбинации [c.62]

Клонирование с помощью рекомбинации позволяет с наи-меньщими усилиями скринировать большое множество космид. В основе метода лежит тот факт, что фаг К в общем случае не является трансдуцирующим фагом, т. е. упаковывается только ДНК, расположенная между двумя os-последовательностями, разделенными достаточным расстоянием. [c.62]

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофи-лизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации in vivo следующим образом. [c.239]

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

Может также быть использован и альтернативный двухступенчатый процесс, приводящий к обмену последовательностями между плазмидой и космидой. При использовании подходящей системы селекции или переноса космида или плазмида может быть получена раздельно. Поэтапно, например, можно ввести мутации, индуцированные в коротком районе гена, клонированного в упаковывающейся плазмиде, обратно в космиду. Наоборот, можно перенести последовательности из космиды в плазмиду для дальнейшего анализа. Как показано на рис. 3.4, такой процесс особенно хорошо контролируется в двухэтапном варианте метода, когда исходная маркерная последовательность (например, /ас-оператор) вводится в результате двойной рекомбинации в тот локус космиды, который должен быть мутагенизирован. Обмен этой последовательности на последовательности, несущие желательную мутацию, легко обнаружить с помощью теста на присутствие или отсутствие /ас-оператора (см. методику получения реверсий). [c.86]

Разработка методов клонирования и определения последовательности оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положило начало новому этану развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инжонер11и. Зти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями. С другой стороны, эпоха массового секвенирования нуклеотидных последовательностей по-новому ставит две кардинальные проблемы биологии проблему структура-функция и проблему молекулярной эволюции. [c.4]

Большинство используемых для клонирования векторов к не содержит функционально активного сайта прикрепления atir ) или функционально активного гена интеграции Ш+). Поэтому они не могут образовывать стабильных лизогенных бактерий. Можно, однако, использовать фаг-помощник, способный к интеграции. После его интеграции гибридный фаг к может встроиться уже в результате рекомбинации с гомологичными ему последовательностями. Такие двойные лизогены образуются с частотой около 1%. Излечивание от них происходит довольно легко, но их можно поддерживать с помощью селекции. [c.106]

Гены всех четырех белков образуют мультигенное семейство, которое, вероятно, произошло от одного предкового гена в результате амплификаций и мутаций как кодирующей, так и регуляторной последовательностей (рис. IV. 1). Имея в распоряжении эти гены, мы можем теперь исследовать механизм, с помощью которого в соседних клетках синтезируется только один из пигментов родопсин в палочках, а чувствительные к красному, зеленому или синему цвету пигменты-в различных колбочках. Клонирование этих генов дает ответ на вопрос и о причине высокой частоты цветовой слепоты у человека. У мужчин, не страдающих дальтонизмом, имеются один ген чувствительного к красному цвету пигмента и разное число (один или три) генов пигмента, чувствительного к зеленому цвету, которые образуют тандем на длинном плече Х-хромосо-мы. Результаты блот-гибридизапии с использованием геномной ДНК мужчин, страдающих разными типами красно-зеленой цветовой слепоты, показывают, что аберрантное цветовосприятие часто бывает связано с мутациями, возникающими при рекомбинациях, сопряженных с неравным кроссинговером [c.341]

Основным классом условно-летальных мутантов, используемым для изучения функции парамиксовирусных генов, являются / -мутанты. Низкий уровень рекомбинации не позволяет построить карту парамиксовирусов с помощью генетических методов. Однако информация о взаимном расположении генов была получена в серии экспериментов по прерыванию процесса транскрипции вследствие УФ-повреждения матриц [13], а также с помощью методов молекулярного клонирования и секвенирования [16]. Описаны, но не нашли широкого применения природные и безусловно-летальные мутации. Правда, спонтанный мутагенез можно исследовать с помощью моноклональных антител. [c.479]

Особый интерес векторная система фага фСЗ 1 представляет для метода мутационного клонирования. Этот метод разработали К. Чей-тер и К. Брутон в 1983 г., использовав в качестве вектора фаг фСЪ, у которого в геноме делетирован участок aft. Такой фаг способен интегрировать свою ДНК в бактериальную хромосому только за счет клеточной системы общей рекомбинации по областям гомологии. На основе векторного фага может быть создан банк генов любого штамма Streptomy es. Гибридными фагами инфицируют клетки и селектируют лизогенные клоны, имеющие нарушения определенного хромосомного гена. Мутация происходит в том случае, когда гибридный фаговый геном интегрируется в целевой ген за счет клонированного в его составе фрагмента хромосомной ДНК. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе генома клонируемые фрагменты. С помощью данного методического приема удается достаточно просто выделять различные гены бактерии-хозяина. [c.278]

При анализе генетической и физической организации СЛОЖНЫХ геномов особенно важными оказываются два свойства рестриктирующих эндонуклеаз. Первое связано с огромным диапазоном специфичностей, проявляемых в совокупности различными рестриктирующими эндонуклеазами, что позволяет разрезать практически любую ДПК на дискретные фрагменты самыми разными способами. Эти фрагменты можно разделить по размерам с помощью гель-электрофореза (рис. П. 18). Распределение фрагменов по размерам, получающееся при расщеплении данной эндонуклеазной ДПК в специфических сайтах, является своего рода отпечатком пальцев , характерным для этой ДПК. Второе свойство эндонуклеаз рестрикции связано со способностью МНОГИХ из НИХ осуществлять несимметричные разрезы двухцепочечной ДПК, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами (рис. П. 19). Это позволяет проводить рекомбинацию ДПК in vitro. Любые два сегмента ДПК со взаимодополняющими концами могут объединиться, в результате чего происходит встраивание фрагментов в фаговую, плаз-мидную ДПК или Другие потенциальные векторы. Такие специфические комбинации вектор—вставка МОЖНО получить В чистом виде путем молекулярного клонирования и амплификации в соответствующих ХОЗЯЙСКИХ клетках (рис. П. 12). [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология