Скрининг библиотек

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

Создание и скрининг библиотек [c.62]

Скрининг библиотек геномных ДНК обычно проводят по следующей схеме. После трансформации высевают клетки на чашки с питательной [c.67]

Рис. 25.9. Скрининг библиотеки с помощью ДНК-зонда с целью обнаружения клона.

З. Получение реплик для скрининга библиотеки [c.53]

Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра (два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп), подращивают при 37°С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации (см. ниже), в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Чашки кладут [c.26]

Один и тот же набор фильтров можно использовать для гибридизации многократно при скрининге библиотеки различными зондами. Удалять меченые зонды от предшествующих циклов гибридизации нет необходимости. Фильтры просто проводят через еще одну реакцию гибридизации, промывают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Новые положительные колонии выявляют путем сопоставления новых пленок с теми, которые были получены в предшествующих гибридизациях. [c.29]

Хотя коллега и увлекающийся человек, но он ваш друг, поэтому вы откликаетесь на его идею, пообещав позвонить через 15 мин, как только переведете аминокислотную последовательность в нуклеотидную. Какие два набора олигонуклеотидов размером по 20 нуклеотидов вы порекомендуете другу-коллеге в качестве наилучших зондов гибридизации для скрининга библиотеки геномной ДНК [c.44]

Используя в качестве зонда ДНК ретровируса, провести скрининг библиотеки для обнаружения клонов, содержащих ретровирусные последовательности. [c.497]

Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага X, поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности. [c.218]

Гетерологичный зонд (Heterologous probe) Сегмент ДНК одного организма, использующийся для скрининга библиотеки сходных ДНК другого организма. [c.546]

Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Как сказано выше, приведенные здесь методики используются для отбора уникальных космидных (или плазмидных) клонов из больших библиотек с применением генетической селекции, а не скрининга библиотек путем гибридизации колоний. Этот подход получил широкое распространение использование в качестве селекционных зондов последовательностей, клонированных в pU 8 и pU 9, позволяет выделить многие космидные клоны из библиотек мыши и человека (см., например, [5, 6, 22]). [c.82]

Имеются антитела к белку (белкам), с помощью которых путем скрининга библиотеки экспрессирующихся клонов (например, клонированных в Xgtll) выделен предположительно соответствующий клон ДНК. Задача сводится к проверке этого [c.141]

Метод трансформации сферопластов используется наиболее широко и обеспечивает относительно высокий уровень трансформации. Это обстоятельство может иметь большое значение прн скрининге библиотеки, клонированной в дрожжах. Однако для отбора нескольких трансформантов при субклонировапии [c.229]

Другой практический вопрос, который следует решать с учетом статистической значимости гомологий - выбор размеров зонда и условий гибридизации при скрининге библиотек генов. Для локализации генов при скрининге стараются использовать зонд, комплементарный нужному участку генома, - в этом случае проходит гибридизация зонд-ген. Однако выбранный зонд может случайно оказаться комплементарен (или почти комплементарен) и другим участкам генома - в этом случае гибридизация будет идти не только с локализуемым геном и процесс скрининга значительно осложнится (Певзнер,Миронов,19876). Если вы хотите облегчить эксперименальную работу и исключить неспецифическую гибридизацию, скажем, в 99% случаев, вам нужно знать статистические характеристики гомологии между зондом и геномам. [c.38]

Проведите скрининг библиотеки стандартным методом. Целесообразно провести скрининг примерно 20 ООО клонов, используя в качестве зонда рВН322, чтобы определить, не содержат ли некоторые бляшки примесей плазмидных последователь- [c.110]

Анализ базы данных EMBL позволил обнаружить значительную гомологию фрагмента RP399 (66-75%) еще с четырьмя секвенированными ранее последовательностями с клонами EHS-1 и EHS-2, выделенными при скрининге библиотеки генов человека с помощью гена env HIV-1 (Horwitz et al., [c.175]

Субклонированную клеточную ДНК использовать для скрининга библиотеки геномной ДНК (и/или библиотеки кДНК), полученной от нормальных мышей. Эти клоны содержат в неизмененном виде интересующий ген. [c.497]

Скрининг библиотеки путем отжигаорадиоактивно меченным зондом, представляющим собой специфичную для Т-клеток кДНК [c.310]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология