Трансфекция клеток СНО

Рис. 18.15. Для картирования генов после трансфекции необходима цитологическая идентификация перенесенного фрагмента хромосомы в клетках, отобранных по активности исследуемых генов. В различных клеточных линиях могут находиться фрагменты разной длины.

Рис. 21.9. Вектор на основе HSV-ампликон-плазмиды. Точка инициации репликации HSV (ori HSV), сигнал упаковки HSV и терапевтический ) ген (ТГ) встраивают в плазмиду Е. соН (HSV-ампликон-плазмида). Проводят трансфекцию клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником HSV, полученной плазмидой. ДНК ампли-кон-плазмиды реплицируется по типу катящегося кольца . 10 амп-ликонов, соответствующих полноразмерному геному HSV, упаковываются в HSV-капсид, который поставляет вирус-помощник HSV. Геном этого вируса не упаковывается. HSV-частицы, несущие множество копий терапевтического гена, высвобождаются при лизисе клетки и используются для трансдукции нейронов.

Для доставки в клетки крупных генетических конструкций (>10 т. п. н.) с помощью эндосом-ного клеточного транспорта, позволяющего избежать лизосомного разрущения ДНК, образуют конъюгат ДНК с другими молекулами. Для этого поли-Ь-лизин ковалентно сшивают с молекулой, связывающейся со специфическим клеточным рецептором, а затем добавляют ДНК. В результате получается компактная, плотно скрученная структура (тор), на внешней поверхности которой располагаются сайты связывания с клеточным рецептором (рис. 21.11). К сожалению, подобный конъюгат, несмотря на свою специфичность, обладает низкой эффективностью трансфекции. Все созданные к на- [c.501]

В процессе выделения хромосом из клеток на стадии митоза эксперименты проводят при пониженных температурах (-Ь4°С), используя пластиковые пипетки во избежание деструкции хромосом Перед механическим разрушением клеток их суспендируют (10 клеток/мл) в гипотоническом растворе, а затем центрифугируют при 2500 д на холоду (примерно 25 мин при 4°С) Выход хромосом составляет около 10% от всех хромосом клеток-доноров Очищенные хромосомы должны быть использованы в опытах по переносу в реципиентные клетки (трансфекция) немедленно [c.185]

Хотя по причинам исторического характера описываемые нами опыты на эукариотических клетках были названы трансфекцией, они в точности соответствуют трансформации у бактерий. В этих экспериментах было не только установлено, что ДНК является у эукариот генетическим материалом, но и была доказана возможность переноса генов между разными видами с сохранением их [c.23]

Гены one, входящие в состав генома ретровирусов, получили название v-on , и именно они придают вирусу способность трансформировать определенный тип клеток хозяина. Локусы с гомологичными последовательностями, найденные в геноме хозяина, получили название с-опс-генов. В большинстве случаев о функциях клеточных генов ничего не известно. Однако в некоторых экспериментах по трансфекции были идентифицированы активные с-опс гены. Их добавление к реципиентным клеткам вызывало трансформацию последних. Такие гены могут быть активированы и при интеграции вблизи них ге- [c.492]

Способ введения экзогенной донорной ДНК в клетки реципиента получил название трансфекции (см. следующий раздел). Селекция клеток на устойчивость к определенным агентам приводит к амплификации эндогенных последовательностей. Механизмы, обеспечивающие способность приспосабливаться при трансфекции и при амплификации, по-видимому, сходны. Нам ничего не известно о ферментативных активностях, участвующих в этом процессе, однако вероятно, что они выполняют родственные функции в обычном процессе воспроизведения ДНК. [c.497]

Рис. 20.29. Продолжение) Б. В полилипкер вектора для улавливания экзонов встроен фрагмент ДНК человека, и эта конструкция введена в эукариотическую клетку (трансфекция). В данном случае экзон содержит функциональные акцепторный и донорный сайты сплайсинга. При процессинге первичного транскрипта удаляются интроны, фланкирующие экзон А, и он оказывается между экзонами 1 и 2. Длина ПЦР-продукта обратного транскрипта показывает, пойман ли искомый экзон между экзонами 1 и 2 и, следовательно, содержит ли его данная вставка.

Эксперименты с трансфекцией были начаты с добавления препаратов метафазных хромосом к суспензиям клеток. Хромосомы включались клетками довольно неэффективно, и с низкой частотой возникали нестабильные варианты. Интактные хромосомы редко сохранялись во время процедуры реципиентные клетки обычно приобретали фрагмент донорной хромосомы (который отличался нестабильностью из-за отсутствия центромеры). В редких случаях возникали стабильные линии в результате интеграции материала донора с хромосомой хозяина. [c.500]

Низкая частота трансфекции делает необходимым использование донорных маркеров, присутствие которых в реципиентных клетках способствует отбору. Следует отметить, что трансфицированные последовательности экспрессируются. В большинстве экспериментов по трансфекции использовали маркеры, связанные с легко определяемыми ферментативными функциями, но в принципе может быть использован любой селектируемый маркер. Это позволяет выделить гены, ответственные за морфологические изменения. Например, могут быть отобраны трансфицированные клетки, которые приобрели трансформированный фенотип (способность неограниченно размножаться с образованием опухоли). Затем можно идентифицировать последовательность ДНК, ответственную за изменение фенотипа. Таким способом были выделены некоторые клеточные оис-гены. [c.500]

Рис. 38.14. С помощью трансфекции можно вводить ДНК в клетки зародышевых линий животных.

Методы переноса генов потенциально приложимы к лечению наследственных аномалий человека. Например, ген, кодирующий нормальный гемоглобин, мог бы быть передан человеку, страдающему серповидноклеточной анемией, болезнью, вызванной присутствием аномальной (3-глобиновой цепи. Если нормальный (З-глобиновый ген будет введен в стволовые клетки, которые дают начало эритроцитам, то последние смогут синтезировать нормальный гемоглобин. Таким образом, индивидуум будет вылечен . Устранение генетических дефектов генома с помощью трансфекции нормальными генами представляется делом отдаленного будущего. Одна из основных трудностей - это низкая эффективность трансфекции. Даже в наиболее удачных случаях доля трансформированных клеток очень мала. Более того, пока трансфекция проводится с культурами клеток, а не с целыми тканями живых организмов, что потребуется для исправления генетических дефектов. [c.321]

Гены, кодирующие несколько вирусных белков слияния, были клонированы и затем использованы Оля трансфекции эукариотических клеток в культуре. Трансфицированные клетки экспрессировали вирусные белки на поверхности мембраны. При кратковременной инкубации при низких pH эти клетки сливались между собой, образуя гигантскую многоядерную клетку. Для наиболее изученного белка слияния из вируса гриппа была определена трехмерная структура методом рентгеноструктурного анализа (см. разд. 8.6.12). Было показано, что при низком pH в белке слияния индуцируются крупные конформационные изменения, приводящие к экспонированию предварительно спрятанной гидрофобной области на поверхность белка. При этом становятся возможными его взаимодействия с липидным бислоем мембраны-мишени. По-видимому, кластер таких гидрофобных областей расположенных в близком соседстве друг с другом в молекуле белка слияния, приводит два липидных бислоя в тесное соприкосновение и дестабилизирует их так что бислои сливаются (рис. 6-87). [c.424]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Влияние соседних оснований яа частоту возникновения мутаций отмечалось и ранее для прокариотических ДНК-полю-юраз. Авторы [17] предполагают, что соседние основания слева и справа могут иметь большое значение для стабилизации неканонической пары, возникающей в ходе репликации. Похожие закономерности выявлены при анализе спонтанных мутаций, возникающих при трансфекции вектора pZI89 в клетки обезьяны. Для всех мутантных позиций оказалось характерным наличие слева вполне определенных нуклеотидов. Консенсус имеет вид ТС, где нуклеотид С - позиция мутирования. Предполагается, что эти мутации возникли в ходе репарации трансфецированной ДНК, поврежденной клеточными нуклеазами [171. [c.103]

С помощью плазмид можно также осуществить Т. протопластов (клетки с удаленной клеточной стенкой), к-рые затем регенерируют в полноценные клетки. ДНК, проникая в них, почти не повреждается и остается двунитевой. Плаз-мидная Т. во многом близка к т.наз. трансфекции, когда бактерии поглощают ДНК фага (вирус бактерий), предварительно выделенную из фаговых частиц. Эта ДНК в бак-терщ1 кодирует образование новых частиц фага, к-рые разрушают затем бактериальную клетку и выходят наружу. [c.626]

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий a l2 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. [c.121]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

Рис. 19.14. Получение трансгенных цыплят трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародыше-вую область свежеотложенных яиц (рис. 19.14). Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток (540-660 рад в течение 1 ч). Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клетками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффективностью. [c.438]

Рис. 21.1. Схематическое представление генной терапии ех vivo. Процедура включает 1) получение от пациента клеток с генным дефектом 2) культивирование изолированных клеток 3) трансфекцию терапевтической генной конструкции в изолированные клетки 4) отбор, выращивание и тестирование трансфицированных клеток 5) трансплантацию или трансфузию трансфицированных клеток пациенту.

Большинство систем доставки генов на основе HSV предполагает использование вируса-по-мощника, который поставляет белки, необходимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться. Для получения рекомбинантного HSV осуществляют трансфекцию ампликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помощником клетку-хозяина. ДНК ампли- [c.498]

Баллистическая трансфекция (Biolisti s, Mi roproje tile bombardment) Введение ДНК в растительные и животные клетки или органеллы с помощью вольфрамовых или золотых шариков. ДНК осаждают, покрывают ею щарики и обстреливают ими клетки. [c.544]

Трансфекция (Transfe tion) Искусственное введение в эукариотические клетки изолированных молекул ДНК. [c.562]

Процесс введения плазмиды в клетку, вызывающий наследственные изменения в ней, называется трансформацией. Процесс инфекции клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, называется трансфекцией. Практически наиболее общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС1з их мембрана становится проницаемой для ДНК. Эффективность проникновения экзогенной ДНК в етку низка. Для плазмид типа рВЯ322 можно получить 10 — 10 трансформантов при добавлении 1 мкг плазмиды к обработанным СаСЬ клеткам, т. е. из каждых 10 — Ю плазмид в клетки попадает только одиа. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается [c.433]

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией Альтернативный метод — использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая клетка инфицируется — (заражается) вирусом В качестве векторов при этом чаще используют литические вирусы типа вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструированные на основе ретровирусов и папилломавирусов [c.202]

Бластоцисты стали родоначальницами плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток типов ES и ЕК. Показано, что, например, ES-клетки доступны культивированию in vitro и после каких-либо манипуляций (например, после введения клонированных генов путем инфекции или трансфекции) можно инъецировать их в бластоцисту и BepHjrrb в живой макроорганизм. ES-клетки колонизируют эмбрион и составляют с ним единое целое, хотя колонизация ими зародышевого пути по разным причинам удается не всегда. Последующие этапы работы с трансгенными животными во многом сходны с. ранее описанными. Таким образом, все три метода получения трансгенных животных можно представить в виде следующей схемы по Д. Мерфи и Дж. Хенсону 1987 г. (см. рис. 166). [c.585]

Рис. 166. Схема получения трансгенных живо- организм выбрасы-тных методом микроинъекции ДНК в оплодотворен- вает 10 15 яйцеклеток ную одноклеточную яйцеклетку 1 - яйцеклетка, 2 - вместо ОДНОЙ В норме, микроишйкция ДНК, 3 - трансфекция ДНК, 4 - Все ЭТИ яйцеклетки ОП-пересадка ядра, 5 - пересадка клетки в бластоцисту. ,,

Такие же результаты получены при добавлении к реципиентным клеткам очищенной ДНК. В этом случае оказалось возможным добавлять определенные последовательности, а не полагаться на случайную фрагментацию хромосом. В результате трансфекции с помощью ДНК получают как стабильные, так и нестабильные линии. Эти эксперименты аналогичны бактериальной трансформации, однако их называдот трансфекцией, поскольку исторически термин трансформация используют при описании изменений, позволяющих эукариотическим клеткам неограниченно размножаться. [c.500]

В опытах по трансфекции массу добавленной к реципиентным клеткам ДНК обычно увеличивают за счет избытка ДНК-носителя, препарата какой-то другой ДНК (например, ДНК спермы лосося). Доказано, что трансфицируемые клетки получают ДНК-носитель в виде последовательностей, фланкирующих селектируемые с каждой стороны. Следовательно, трансфекция осуществляется структурой ДНК, состоящей из ряда сцепленных последовательностей всех типов, присутствующих в препарате донора. Поскольку ревертанты по селектируемому маркеру утрачивают весь этот материал, кажется вероятным, что трансфицируемые клетки приобретают только одну такую структуру ДНК. Данная структурная единица может образовываться благодаря конкатемерному сцеплению донорных последовательностей в ходе реакции, которая проходит очень быстро по сравнению с другими событиями, вовлекаемыми в процесс трансфекции. Такая трансфицируемая единица может иметь протяженность около 1-10 п.н. Мы не можем установить с помощью метода гибридизации, сцеплена ли донорная единица с хромосомной ДНК реципиента (интересующие нас концевые фрагменты представлены в слишком незначительных количествах). Вероятно, что первая стадия процесса заключается в образования нестабильных внехромосомных единиц, которые впоследствии стабилизируются в результате интеграции. В некоторых клеточных линиях методом гибридизации in situ было показано, что трансфицированные клетки содержат донорный материал, интегрированный в хромосомы хозяина. Любая определенная клеточная линия имеет только один сайт интеграции однако сайты в каждой линии различны. Вероятно, выбор сайта для интеграции - случайное событие иногда оно связано с большими хромосомными перестройками. [c.500]

Препарат хромосом человека, не содержащий примеси клеток, может быть получен при соответствующей обработке, вскрывающей плазматическую и ядерную мембраны клетки. В семидесятых годах были разработаны методы фракционирования и проточной микрофлуоримет-рии, позволяющие осуществлять сортировку хромосом на фракции, содержащие индивидуальные хромосомы человека высокой чистоты (рис. 18.13). Когда свободные хромосомы добавляют к культивируемым клеткам мыши, то эти клетки могут захватывать целые хромосомы в процессе эндоцитоза. Внутри реципиентной клетки захваченные хромосомы обычно деградируют, распадаясь на фрагменты. Если такие фрагменты содержат центромерные области, то они могут поддерживаться как единое целое. Фрагменты, лишенные центромеры, могут транслоцироваться на мышиные хромосомы. В том и другом случае определенные человеческие гены будут экспрессироваться в гибридных клетках (рис. 18.14). Встраивание фрагментов в хромосому мыши происходит с очень низкими частотами, от 10 " до 10 на клетку. Встраиваемые фрагменты могут быть как очень мелкими, не видимыми в световой микроскоп, так и достаточно крупными, включая плечи хромосом и даже целые хромосомы. Такой перенос генетического материала от донора, сопровождающийся встраиванием в хромосомы реципиента, называется трансформацией (как у бактерий) или трансфекцией. [c.304]

Трансфекция. В генетике соматических клеток синоним трансформации, т. е. включение генетического материала до-норного организма в хромосому реци-пиентной клетки. В генетике бактерий-инфекция клеток фаговой ДНК. [c.316]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология