Получение трансгенных линий

Получение трансгенных линий [c.350]

После того как первичные трансгенные животные идентифицированы (разд. 10.4.2), необходимо заняться их скрещиванием для получения трансгенных линий. Разумеется, такие линии должны быть получены прежде, чем животное-основатель будет умерщвлено для детального исследования. Лучще, если животное-основатель самец. Самца можно быстро скрестить с несколькими самками, тогда как самка-основатель линии должна выносить и выкормить хотя бы один помет, прежде чем ее можно будет забить. Желательно провести гибридизационный анализ и идентифицировать трансгенных животных первого поколения еще при жизни родителей. [c.350]

Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из са-мок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в суррогатную мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Для идентификации трансгенных животных вьщеляют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. [c.421]

В среднем лишь несколько из каждых ста трансгенных растений отбирают для получения новой линии (сорта). Помимо эффективной работы введенного гена трансгенное растение дол- [c.104]

Для экспериментов по получению трансгенных мышей требуется относительно большая популяция лабораторных животных. Экспериментальная схема (рис. 10.2) предполагает использование различных линий на разных этапах работы. Рассмотрим каждый из этих этапов в отдельности. [c.315]

Трансплантация стволовых клеток иммунной системы человека сй-мышам и получение линий трансгенных мышей - весьма трудоемкие способы производства моноклональных антител человека. Поэтому ученые пытаются создать генноинженерные методы получения антител человека, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффективных бифункциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушать ее. [c.215]

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок. [c.434]

На первом этапе практического применения молекулярной генетики были созданы рекомбинантные микроорганизмы, а позднее трансгенные клеточные линии млекопитающих, которые выращиваются в системах биореакторов и способны производить белки, закодированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были успешно использованы в получении ценных продуктов фармакологического и медицинского на-238 [c.238]

Лекарственные белки, получаемые в генно-инженерных клетках млекопитающих, могут быть правильно модифицированы, с активностью, сравнимой с природными белками, но выход белка из культуральных клеток очень низкий. К тому же создание клеточных линий является сложной и дорогой процедурой. Поэтому стоимость полученных рекомбинантных белков, продуцируемых с помощью клеточных систем, в 1000 раз превышает стоимость при их производстве с использованием трансгенных животных. [c.241]

Какие преимущества имеют трансгенные животные по сравнению с рекомбинантными микроорганизмами и клеточными линиями млекопитающих в получении ценных фармакологических веществ [c.244]

Еще один важный результат, который был получен при исследовании ретровирусов,- создание на их основе рекомбинантных векторов (разд. 5.7. г). Эти векторы оказались особенно ценными для введения новых генов в эмбрионы млекопитающих на ранних стадиях развития, а значит, практически во все клетки организма, включая клетки зародышевой линии получающиеся при этом животные называются трансгенными. Роль трансгенных животных в исследовании тканеспецифичной экспрессии генов и действия онкогенов описана в гл. 8. [c.351]

Разработка системы генетической трансформации культивируемых клеток млекопитающих позволила подойти к решению такого важного вопроса, как введение чужеродных генов в организм животных и получение линий животных, передающих по наследству приобретенные гены — трансгены. Таких животных принято называть трансгенными животными. [c.448]

Микроинъекцгш ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий - непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. [c.436]

Чтобы получить нокаутирующую мутацию (kno k-out mutation), последовательность клонированного гена должна быть изменена in vin o и затем введена в культуру эмбриональных стволовых клеток (ES). С низкой частотой мутировавший трансген замещает его нормальный аллель в хромосоме путем гомологичной рекомбинации - процесс, названный targeting. ES клетки, которые содержат нокаутированную мутацию, могут быть использованы, чтобы создать химеры, которые пригодны для получения трансгенных линий, несущих нокаутированную мутацию. [c.267]

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать на- [c.128]

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекщш на устойчивость животных к различным заболеваниям невелики, но обнаде-живающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепаразитарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх -мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх был вьщелен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследования в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лакто-ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистентность против аденовируса Н5 (Ads) более высокую на 90 — 98% по сравнению с контрольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза. [c.130]

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и клеточными системами. Важно, что новые белки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут бьггь модифицированы, их активность сравнима с активностью протеинов. Для молочного производства представляет большой рштерес получение целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы с целью выхода белков с молоком. Один из основных этапов получения трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, — идентификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы. [c.131]

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференци-ровке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (Е5). Е8-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипо-тентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. [c.422]

Рис. 19.4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых (Е8) клеток. Е8-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несушим трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку суррогатных матерей. Скрещивая животных-ос-нователей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей.

Рис. 19.14. Получение трансгенных цыплят трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Д ля образования трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких трансгенных животных (трансгенные особи, родившиеся из инъецированных эмбрионов), все или, по крайней мере, часть половых клеток которых содержат трансген. При исследовании родившихся животных и полученного от них потомства было показано, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток), могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеточных линий, содержащих трансген, имеют нетрансгенные линии. При получении от таких животных трансгенного потомства и при выделении трансгенных линий могут возникнуть трудности. Так, если клетки гонад не содержат трансген, потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенной родительской формы. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками (Wilki Т.М. е1 а ., 1986). Поэтому трансген не передается потомству с ожидаемой согласно закону Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. [c.228]

Показано, что сперматозоиды являются не единственными зародышевыми клетками самца, которые могут быть использованы в получении трансгенов. В 1994 г. Brinster et al. продемонстрировали, как сперматого-нии могут быть взяты от одного самца и пересажены в семенники самца того же или другого вида и становятся функционирующими. Это дает возможность включения экзогенного гена в эти клетки до пересадки их в семенники другого животного. Трансформация линий зародышевых клеток самца in situ была сообщена рядом исследователей через прямую инъекцию ДНК в семенник живых животных (Kim J.-H. et al., 1997). Это может представлять интерес для видов животных, у которых перенос сперматозоидов в семявыводящие канальцы технически невозможен. [c.231]

И недалек тот день, когда привычные технологии получения лекарственных препаратов из донорской крови человека или с помощью биореакторов с использованием генно-инженерных микроорганизмов и клеточных линий будут в основном заменены трансгенными животными. Мне удалось в этом убедиться при посещении крупнейших фирм, занимающихся этой проблемой Джинзайм (США), ППЛ Терапевтике (Англия — США), Ред. Кросс (США), Фарминт (Голландия). По заказу фармацевтических фирм работает фирма Инфиген (США) по получению трансгенных животных, продуцирующих с молоком ценные лекарственные вещества. [c.241]

III. Эффективность микроинъекционного метода. Эффектна иость процедуры получения трансгенных мышей путем микроинъекций сильно варьирует от эксперимента к эксперименту. В оптимальных условиях 60—80% яиц переживает инъекцию. Из них 10—30% имплантируется в организм реципиентной самки, продолжает нормально развиваться и дает начало потомству. 10—30% новорожденных мышей оказываются трансгенными. В какой-то степени успех эксперимента зависит от превходящих условий, например от сноровки экспериментатора. Однако определяющее значение здесь имеют качество инъецируемой ДНК (разд. 10.4.1) и выбор линии мышей (разд. 10.2.2.1) поэтому эти два параметра следует строго контролировать. [c.313]

Оплодотворенные яйцеклетки выделяют из организма самки-донора после ее спаривания с самцом-производителем. Выбор линии мышей для этой стадии работы имеет принципиальное значение. Бринстер и др. [15] сравнивали эффективность всей процедуры получения трансгенных мышей, отбирая в качестве исходного материала оплодотворенные яйцеклетки инбредных мышей С57В1/6 и гибридные яйцеклетки С57В1/6ХСВА/Л. Было показано, что многие контрольные параметры различаются у мышей разных линий. В частности, это касается формирования яйцеклеток в организме донорной самки и жизнеспособности яиц, перенесших инъекцию. В целом работа с гибридными яйцеклетками оказалась в восемь раз эффективнее, чем аналогичные манипуляции с инбредными яйцеклетками. Инбредные зиготы следует использовать только в тех случаях, когда предъявляются специальные требования к генетической конструкции живот ных. [c.315]

Для изучения генетической природы толерантности экспериментально полученных трансгенных мышей, у которых островковые клетки поджелудочной железы экспрессировали вирусный антиген, гемагглютинин (ГА) вируса гриппа, а Т-клетки — ТкР, специфичный к этому антигену, (дважды трансгенные мыши), скрещивали с мышами, отличающимися по генам не-МНС, т. е. по генетической основе. У мышей одной линии (генетическая основа BALB/ ) Т-клетки, реактивные по отношению к ГА, продуцировали большие количества ИЛ-4 и ИФу признаков воспалительного процесса в поджелудочной железе у этих мышей не было. ГА-реактивные Т-лимфоциты мышей другой линии (генетическая основа B10.D2) продуцировали лишь цитокины, свойственные Тх1-клеткам, и были способны инфильтрировать островки поджелудочной же-.тезы, вызывая диабет. Очевидно, что иммунное отклонение здесь контролировали гены, составляющие генетическую основу многие из этих генов совместно регулируют чувствительность к аутоиммунному заболеванию. [c.267]

Принимая во внимание накопленный экспериментальный материал, мы заключили, что обнаружение экстрахромосомных экзогенных ДНК в бабочках Fq представляло собой закономерный исход всех экспериментов по трансгенезу на тутовом шелкопряде и происходило с вероятностью 5%, равной вероятности получения трансгенного шелкопряда в результате единичной микроинъекции. Но и эта сравнительно небольшая вероятность получения трансгенных особей представляется значительной, если принять во внимание отсутствие во вводимых рекомбинантных конструктах ori / ARS-элементов. Наличие в бабочках Fq экстрахромосомной экзогенной ДНК, прошедшей (по минимальной оценке) Ю -кратную репликацию, предполагает, что введенные молекулы ДНК приобрели подобные элементы за счет внутренних перестроек или за счет рекомбинации с молекулами фракции эндогенной экстрахромосомной ДНК шелкопряда (рис. 83 и 84). В обоих случаях экзогенные рекомбинантные ДНК должны были бы претерпеть структурные перестройки, что и показал блот-гибридизационный анализ. Одним из важных его результатов явилось обнаружение гомологичной геному шелкопряда дополнительной ДНК в составе автономных трансгенов уже в особях-основателях трансгенных линий (рис. 84). [c.228]

Клетки колонизируют эмбрион и участвуют в его нормальном развитии, давая начало клеткам всех типов соматических тканей и нередко клеткам зародышевого пути. Прежде чем инъецировать ES-клетки в бластоцисту, в них вводят целевые трансгены — либо путем трансфекции, либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами. Практическое достоинство этой методической схемы состоит в том, что она дает возможность проводить селекцию трансформированных ES-клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его хромосомная локализация или характер экспрессии. Все получаемые по такой схеме первичные трансгенные животные — мозаичные организмы, которые состоят из содержащих и не содержащих трансген клеток поэтому для получения чистых трансгенных линий необходима селекционная работа. Между тем довольно часто ES-клетки оказываются не способными колонизировать зародышевые ткани, что, по всей вероятности, объясняется накоплением хромосомных нарушений в процессе культивирования и селекции in vitro. [c.450]

Сложность генома млекопитающих, их эмбрионального развития, длительный период, предшествующий размножению, и трудности изучения большого числа индивидуальных животных делают генетический анализ этих систем затруднительным. Направленная инактивация генов является чрезвычайно важным методическим приемом, применяемым для получения трансгенных животных. Наибольшее развитие такие работы получили в экспериментах на мышах. Создание линий мышей, гомозиготных по направленно инактивированному гену, позволяет изучать детерминируемые данным геном свойства на уровне организма. Благодаря появлению методологии получения нокаутных мышей молекулярная генетика этой удобной лабораторной модели стала развиваться небывалыми темпами. [c.453]

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

В 1980 г. Верховный суд США вынес определение, что изобретение, которое включает что-либо, созданное под солнцем руками человека , является охраноспособным. В 1988 г. было запатентовано первое животное, полученное с помощью методов генной инженерии, — трансгенная мышь. В ее ДНК бьш встроен ген, ответственный за образование злокачественных опухолей (онкоген), который находился под контролем промотора на основе длинного концевого повтора вируса опухоли молочных желез мыши (ЬТЯ ММТУ). Онкоген представлял собой ген туе вируса миелоцитоматоза цыпленка ОКЮ. Изобретение заключалось в клонировании химерного гена ЬТК ММТУ—т>>с в плазмиде, введении линеаризованной плазмидной ДНК в мужской пронуклеус оплодотворенных одноклеточных мышиных яйцеклеток, идентификации потомков, экспрессирующих ген туе, и получении линий трансгенных мышей. У животньгх одних линий ген туе экспрессировался в различных тканях, у животных других экспрессия ограничивалась одной или несколькими тканями. По утверждению Ледера [c.538]

Однако даже у мыши единичного онкогена обычно не достаточно для превращения нормальной клетки в раковую. Это отчетливо продемонстрировано на транегенных мышах. Можно сшить онкоген в виде фрагмента ДНК. взятого из вируса или опухолевой клетки, с подходящей промоторной последовательностью ДНК, и ввести полученную молекулу в ядро мышиной яйцеклетки. Такая рекомбинантная молекула ДНК часто встраивается в одн> из хромосом, в результате чего получается линия транегенных мышей, несущих онкоген во всех своих клетках. Этот онкоген может экспрессироваться во многих тканях или же лишь в некоторых избранных , в соответствии с тканевой специфичностью соединенного с ним промотора. Обычно у мышей, которым ввели таким способом онкогены туе или H-ras, экспрессирующие их ткани резко увеличиваются в объеме, разрастаясь до чрезмерной величины, а отдельные клетки со временем подвергаются дальнейшим изменениям и дают начало опухоли. И все же подавляющее большинство клеток трансгенной мыши, экспрессирующих туе- или H-ras-онкогены, опухолей не образуют, что говорит о недостаточности присутствия одного онкогена для опухолевой трансформации. [c.475]

Одним из генов, имеющих фармакологическую ценность, является ген, кодирующий гранулоцит-колоний-стимулирующий фактор (Г-КСФ) человека. В настоящее время с нашим участием ведутся исследования по анализу экспрессии гена Г-КСФ, находящегося под контролем промотора и 3 -фланкирующей области гена а у-казеипа быка (Дворянчиков и др., 2000) в молоке полученных нами трансгенных мышей (работа проводится совместно с исследователями государственного университета г. Рио-де-Жанейро, Бразилия). Методом иммуноферментного анализа у трансгенных самок в лактирующей молочной железе обнаружен рекомбинантный белок на уровне 0,1-0,3 мкг в мл. Были проведены тесты на биологическую активность белка в молоке трансгенных мышей с помощью Г-КСФ-зависимой миелоид-ной линии клеток мышей, первичной культуры костного мозга мышей и человека в агаре. Оба теста выявили стимулирующую активность молока в разведении, соответствующей концентрации 1-2 пкг/мл рекомбинантного белка (Dvoryan hikov et al., 2003). Предполагается, что данная генетическая [c.189]

Недавно с нашим участием была предпринята попытка получения ЭСК козы (Матвеева и др., 2000). Трансгенные козы являются наиболее подходящими кандидатами в продуценты терапевтических рекомбинантных протеинов, и ЭСК, технология получения которых у с/х животных все еще находится в стадии разработки, могли бы служить идеальной системой для этих целей. Работа проводилась на базе государственного университета Рио-де-Жанейро (Бразилия). С целью получения ЭСК нами были использованы бластоцисты коз местной породы (штат Сеара, Бразилия). Бластоцисты помещали в соответствующие условия культивирования. В результате было выделено несколько клеточных линий в одной из них преобладали эндодермально-подобные клетки с отрицательной активностью щелочной фосфатазы, тогда как другие представляли смесь клеток, подобных ЭСК с положительной и отрицательной активностью щелочной фосфатазы и способностью к спонтанному образованию эмбриоидных тел. В настоящее время проводится оценка плюрипотентности этих клеток (рис. 71-73). [c.207]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология