Анализ методом дот-блот

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Слот (и дот)-блот-анализ относится к экспресс-методам, т. е. он относительно прост и требует немного времени. Однако этот вид гибридизационного анализа применим лишь в случае [c.346]

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

S.4.2.4. Определение специфичности антител методом вестерн-блот-анализа [c.168]

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Б. Анализ методом дот-блот [c.33]

Анализ рекомбинантных продуктов включает такие методы, как гель-электрофорез с последующим окрашиванием кумасси, вестерн-блот-анализ, иммуноферментный анализ и другие широко используемые процедуры, не требующие каких-либо специальных модификаций для работы с дрожжами поэтому мы их здесь не описываем. [c.236]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Титр вируса в культуральной среде инфицированных клеток можно определить с помощью целого ряда методик, в основе которых лежат физические, биохимические или биологические методы анализа. Наибольшее распространение получил способ, заключающийся в количественном определении вирусной геномной РНК в культуральной среде с помощью гибридизации с меченным ДНК-зондом. Эту стандартную процедуру дот-блот-гибридизационного анализа проводят после концентрирования препарата вируса, как описано в табл. 9.4. Количественное определение достигается путем сравнения интенсивности полученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов гибридизации точно титрованного вируса (разд. 9.6.1.3) или известных количеств РНК, или ДНК, нанесенных на фильтр. Используя разные ДНК-зонды, можно оценить концентрацию индивидуальых компонентов в вирусном препарате и непосредственно определить, содержит ли вирус интересующие нас последовательности. [c.297]

Метод анализа выделенной ДНК выбирают, исходя из природы трансгена. Если трансген имеет гомологию с каким-либо участком генома мыши, используют блот-гибридизацию [26, 28[. Если же гомология с мышиной ДНК отсутствует или она незначительна, можно ограничиться дот-блот- или слот-блот-анализом [29]. [c.343]

Рис. 9-12. Радиоавтограф, полученный при анализе методом блот-габридизации ДНК из политенных хромосом (Р) и диплоидных тканей (О) (задача 9-14). Числа наверху обозначают клонированные фрагменты ДНК, использованные в качестве зондов 2851 и 2842-фрагменты изучаемой области, имеющей длину 315 т. п. н. (см. рис. 9-13) фрагмент 2148-из другой области генома, он использован для калибровки количества ДНК, нанесенного на гель.

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

Нами были проведены серии микроинъекций в грену различных рекомбинантных ДНК с последующим анализом их судьбы методом блот-гибри-дизации. На первом этапе осуществлялась совместная микроинъекция конструкций, что позволило быстро получить исходную информацию. С этой целью в ранние эмбрионы шелкопряда была перенесена комбинация из двух плазмид представляющая систему транспозиции, основанную на функции Р-элемента дрозофилы и комбинация плазмид рр25.1 (кодирующей Р-эле-мент дрозофилы) и pPr llLTRl.5 (несущей копии LTR вируса RSV). В обоих случаях были получены однотипные результаты. [c.227]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

Иногда для достижения поставленной цели применяется метод поэтапного клонирования. На первом этапе клонируется ген метилазы. Для определения предположительной локализации рестриктазного гена проводится физическое картирование последовательностей донорной ДНК, окружающих ген метилазы. В качестве зонда для блот-гибридизации используется ген метилазы [147, 148] или синтетические олигонуклеотиды [124]. Донорная ДНК перед лигированием обрабатывается отобранными таким образом рестриктазами с целью вырезания фрагмента предположительно содержащего не только ген метилазы, но и рестриктазы. Однако не всегда реализация такого подхода дает положительный результат. Поучителен в этом отношении пример по клонированию генов гт Dde I [124]. В этом случае на первом этапе удалось клонировать только ген метилазы. Впоследствии это нашло объяснение в том, что при получении банка генов провели исчерпывающий гидролиз донорной ДНК рестриктазой Hind ni, которая как потом оказалось имеет сайт в гене рестриктазы. Для картирования генов гт Dde I методом блот-гиб-ридизации в качестве молекулярных зондов применили метилазный ген и смесь синтетических олигонуклеотидов, имеющих гомологию с геном рестриктазы. Структура олигонуклеотидов была предсказана на основе анализа аминокислотной последовательности N конца рестриктазы, выделенной в гомогенном состоянии из природного продуцента. В результате проведенных исследований было определено, что гены гт Dde I расположены на Pst I фрагменте хромосомной ДНК величиной 4,8 кб. Однако попытки клонировать этот фрагмент не дали [c.187]

Недавно у мышей удалось осуществить замену гена косвенным, достаточно трудоемким путем. Процедура сводится к следующему. Сначала фрагмент ДНК, содержащий нужный мутантный ген, вводят путем трансфекции в специальную линию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных из эмбриона и выращиваемых в культуре. Клеткам дают возможность размножаться в течение некоторого времени, после чего методом блот-анализа по Саузерну выявляют редкие колонии, в которых общая рекомбинация привела к замене гена, и отдельные клетки из этих колоний имплантируют в ранний эмбрион мыши. В этой новой для них среде выделенные из эмбриона стволовые клетки часто пролиферируют, образуя крупные участки в теле нормальной мыши. Мышей, у которых произошла замена гена в клетках зародышевого пути, скрещивают, чтобы получить самца и самку, которые окажутся гетерозиготными по этому признаку (т. е. будут иметь одну нормальную и одну мутантную копию данного гена). Если теперь скрестить этих животньк, то одна четвертая часть их потомства будет гомозиготной по [c.339]

Рис. 5-90. Выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) блот-анализом по Саузерну Для простоты в хромосомах показано лишь несколько сайтов рестрикции, хотя в действительности их многие тысячи. Если до воздействия рестрицируюшей нуклеазой провести амплификацию соответствуюш,его участка методом ПЦР, этот же тест можно провести без радиоизотопов и от блот-анализа отказаться

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Очень важно установить, имеются ли в сыворотке иммунизированной мыши антитела к белкам, кодируемым вставочными последовательностями. Для этого используют ряд подходов в зависимости от того, насколько легко получить полноразмерный нативный продукт ОРС. Если известно, что ОРС экспрессируется в культивируемых клетках определенной линии или что ее продукт в достаточном количестве присутствует в определенной ткани, тогда можно определить активность сыворотки в отношении данных клеток или тканей с помощью иммуноци-тохимических методов, иммунопреципитации или вестерн-блот-анализа. По нашим данным, при работе с ОРС млекопитаю- [c.182]

Уровень РНК в разных клетках можно сравнивать, пользуясь методом позерн -блот-анализа [27]. Общий план эксперимента аналогичен тому, который рассматривался в предыдущем разделе. Стандартный препарат РНК-копий анализируемых последовательностей можно приготовить и количественно оценить с помощью системы транскрипции in vitro SP6 (см. гл. 1 этого тома). [c.263]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология