Нитроцеллюлоза, нитроцеллюлозный гель фильтр

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Гель, окрашенный бромидом этидия, необходимо защищать от воздействия света. Для хранения, окраски, отмывки и гибридизации используются специальные закрывающиеся контейнеры. Для переноса ДНК мы применяли нитроцеллюлозные фильтры чаще, чем найлоновые, хотя в последнем случае отношение сигнал/фон оказывается ниже. При использовании нитроцеллюлоз-ных фильтров в частичном гидролизате ДНК млекопитающих с помощью уникального зонда при двухдневной экспозиции обычно удается выявить 4—6 полос. Наибольшее количество фрагментов, которые мы были в состоянии выявить с таким зондом,— [c.79]

Значительная доля ДНК вымывается из геля током жидкости, идущим от нижнего листа фильтровальной бумаги через гель и нитроцеллюлозный фильтр к верхним, первоначально сухим, слоям бумаги. На нитроцеллюлозе эта ДНК прочно сорбируется в тех местах, которые лежат непосредственно над полосами ДНК в геле. Высокая концентрация соли способствует сорбции. После этого с помощью известных методов гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах (их рассмотрение выходит за рамки этой книги) можно идентифицировать отдельные полосы ДНК в этой копии , а следовательно, и в самом геле. [c.162]

На рис. 19.7 схематически изображена последовательность операций по переносу фрагментов ДНК. Агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, замоченную в концентрированном солевом растворе. Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр и сверху помещают yxyio фильтровальную бумагу. Солевой раствор впитывается в сухую фильтровальную бумагу. Чтобы это произошло, он должен пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается нитроцеллюлозой. [c.243]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

Можно также выявлять секретируемые антитела с помоп ю переноса иммуноглобулинов на нитроцеллюлозные фильтры. С этой целью на обезвоженный агаровый гель помещают квадратики нитроцеллюлозы (НЦ) размером 40X40 мм, предварительно смоченные в ЗФР. На НЦ-фильтры кладут квадратики фильтровальной бумаги Whatman того же размера и инкубируют предметные стекла при 37 °С во влажной атмосфере. Антитела пассивно диффундируют в НЦ и связываются с ней. Максимальное связывание достигается через 5 ч, однако минимальное связывание антител можно обнаружить уже через [c.262]

Естественно, что перенос можно ускорить наложением электрического поля в поперечном направлении — от геля к нитроцеллюлозе или ДБМ-бумаге, т. е. заменить вымывание ДНК из геля ее электрофоретической элюцией. Недавно было описано очень простое устройство для этой цели в виде разъемной рамки из плексигласа с диализной пленкой и электродами из платиновой проволоки Bittner et al., 1980]. Гель агарозы кладут на пропитанный буфером нитроцеллюлозный фильтр или ДБМ-бумагу, с обеих сторон к ним прикладывают пропитанные буфером листки фильтровальной бумаги и все это зажимают между двумя половинками рамки. Ее помещают в ванночку с тем же буфером и включают напряжение поперечного электрофореза . Напряженность электрического поля приходится регулировать в зависимости от величины фрагментов ДНК, чтобы мелкие фрагменты не проскакивали через нитроцеллюлозу или ДБМ-бумагу до того, как они успеют закрепиться на них. Очень крупные молекулы ДНК авторы рекомендуют фрагментировать после электрофореза, обрабатывая их малой концентрацией ДНКазы прямо в геле. [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология