РНК-зонды для прогулки по геному

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Прогулка по хромосоме . Метод гибридизации полезно использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК извлекается первоначально какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длиннее зонда, и ее концы будут перекрываться с другими фрагментами данного гена в этой библиотеке, т. е. будут по крайней мере частично гибридизоваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гибридизоваться со следующими и т.д., пока весь структурный ген не будет полностью идентифицирован серией перекрываю- [c.127]

Нет сомнений, что метод прогулка вдоль хромосомы будет широко использоваться в будушем для построения молекулярных карт больших участков хромосомы, а также для выделения и характеристики генетических областей, для которых единственными зондами являются соседние гены. Это существенно для обнаружения и характеристики пока не известных генов, а также при картировании элементов, важных для эволюции хромосом млекопитающих, таких как горячие точки при рекомбинации. [c.37]

Прогулка по хромосоме ( hromosome walking) Метод идентификации нуклеотидных последовательностей, фланкирующих известные гены, для которых имеются олигонуклеотидные зонды. Фланкирующие последовательности используются затем в качестве зондов для идентификации прилегающих к ним последовательностей, и т,д. [c.557]

Рис. 5-85. Использование перекрывающихся фрагментов для картирования интересующего нас гена путем прогулки по хромосоме . Для того чтобы сократить время прогулки , наиболее пригодны геномные библиотеки, содержащие очень крупные клонированные молекулы ДНК. Зохвдом для каждого следующего клона служит короткий Р-фрагмент ДНК одного из концов предыдущего идентифицированного клона. Если, например, используется правый конец, то и перемещение происходит вправо , как в случае, представленном на этом рисунке. Короткий концевой фрагмент удобен в качестве зонда еще и потому, что это снижает вероятность присутствия в зогще повторяющейся последовательности ДНК, которая могла бы гибридизоваться со многими клонами из разных частей генома и тем самым прервать прогулку .

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Рис. 36.10. Метод прогулка по хромосоме . Пусть необходимо обнаружить ген X в рамках протяженного фрагмента ДНК. Точное положение гена неизвестно, однако имеется первичный зонд ( ), соответствующий некоему участку генома (показан в данном случае на 5 -конце исследуемого фрагмента ДНК). Кроме того, имеется библиотека перекрывающихся фрагментов генома. (Для упрощения на рисунке изображены только пять фрагментов.) Первичный зонд гибриди-зуется только с клонами, содержащими фрагмент 1. Этот фрагмент можно использовать далее в качестве зонда для выявления фрагмента 2. Процедура последовательной гибридизации повторяется вплоть до обнаружения фрагмента 4, который гибридизуется с фрагментом 5, содержащим искомый ген X.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология