Замораживание клеток

Замораживание клеток и оценка выхода [c.110]

Рис. 8.4. Материалы, используемые для замораживания клеток. Справа (сверху вниз) — пластиковая ампула и стеклянные ампулы объемом 1 и 2 мл. После запаивания и охлаждения до —70 С ампулы вставляются в держатели (в середине) и помещаются в контейнер (слева) для погружения в сосуд с жидким

Прежде чем дать краткую характеристику некоторых свойств наиболее известных криопротекторов, небезынтересно-вспомнить открытие криозащитных свойств у глицерина. Еще в 1913 г. русский ученый Н. А. Максимов изучал криозащитное действие растворов различных веществ, в том числе глицерина и сахарозы, на растительных объектах. В его опытах глицерин оказывался менее эффективным криопротектором, чем сахароза. На криозащитные свойства глицерина в последующем обратили внимание советские ученые А. Д. Бернштейн, В. И. Петропавловский (1937), применив его для замораживания (до —2ГС) спермы ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Однако-их результаты не получили развития и были забыты. Позднее Дж. Ростан (1946) продемонстрировал возможность хранения спермы лягушки в течение 1 суток при —(4—6)°С в среде, содержащей 10—207о глицерина. Но эти опыты не привлекли внимания ученых и понадобился случай (английские исследователи К. Полдж и О. Смит (1949), работая над проблемой замораживания клеток в растворах сахаров, обнаружили, что-глицерин обладает криозащитными свойствами в отношении спермиев петуха), чтобы внимание ученых было привлечено к глицерину уже надолго. [c.31]

Анабиоз имеет место и при замораживании клеток, когда свободная вода внутри клетки превращается в лед, И в этом случае физиологические процессы максимально замедляются или даже прекращаются, так как биохимические реакции в твердой фазе льда идти не могут из-за отсутствия свободного движения молекул. При замораживании клеток, особенно медленном, образуются крупные кристаллы льда внутри клетки, которые могут вызвать повреждения клеточных структурных элементов. Следовательно, клетки надо обезвоживать или замораживать так, чтобы не допустить необратимые изменения в них, в противном случае наступает летальное состояние — смерть, а не анабиоз. Зависимость жизненных процессов от воды иллюстрируется рис. 7. Если биополимеры и мембраны клеток необратимо теряют свои главные свойства — обмен веществ, способность к воспроизводству, способность к саморегуляции, тогда даже в присутствии воды жизнь прекращается и наступает летальное состояние. [c.26]

Среду для замораживания клеток получают смешиванием при 4°С 50% ростовой среды, 10% ДМСО и 40% сыворотки. Берут 50 мл суспензии клеток, осаждают их центрифугированием, удаляют супернатант. Клетки (5-10 —10 ) суспендируют в 1 мл среды для замораживания и переносят в специальные ампулы. Их выдерживают в течение часа при 4°С, затем помещают в коробку из пенопласта и переносят в холодильник на —70°С, где выдерживают в течение ночи. На следующий день ампулы с клетками помещают в жидкий азот. [c.314]

Применяемые программы охлаждения весьма разнообразны. Для них характерны медленные скорости охлаждения, реализуемые либо на всех этапах охлаждения, либо до определенных температур с последующим погружением в азот. Оптимальным для целого ряда клеток оказался 2-ступенчатый режим с температурной остановкой [13—15]. Экспериментальные данные показали, что замораживание клеток перевиваемых культур без криопротектора по 2-этапной программе со скоростью 30—40 °С/мин с температурной остановкой обеспечивало в 2 раза большую сохранность, чем замораживание со скоростью 1—2 °С/мин. Так, при замораживании клеток 5р 2/0 по 2-этапной программе сохранялось 45—50 % клеток, а при медленном замораживании — 20—25 %. [c.64]

Замораживание клеток насекомых [c.247]

В тех случаях, когда возникает необходимость в нескольких держателях с замороженными ампулами для каждого штамма клеток, может возникнуть необходимость в специальном помещении для хранения клеток в жидком азоте. Несмотря на это, рекомендуется всегда использовать замораживание клеток, поскольку в случае бактериального или другого загрязнения пассируемых клеток эта процедура всегда обеспечит исследователя клетками-дублерами. [c.102]

Замораживания клеток. 1. Готовят среду для замораживания клеток, состоящую из среды культивирования, 20% СПК и 10% диметилсульфоксида. Полученную среду стерилизуют через фильтры и хранят при 4°С. [c.110]

Для большинства видов наиболее эффективными температурами являются температуры чуть выше 0°С, а именно 1—2 С, но температуры в пределах от —1 до -1-9 °С оказывают почти такой же эффект. Следовательно, замораживание клеток ие обязательно для того, чтобы вызывать изменения, имеющие место во время яровизации этот факт позволяет предположить, что в яровизации в большей степени участвуют физиологические, а не чисто физические процессы. Такое заключение подтверждается неэффективностью обработки зерна ржи холодом в анаэробных условиях, что свидетельствует о существенном значении аэробного дыхания. При культивировании выделенных. зародышей на средах, содержащих и не содержащих сахар, было установлено, что снабжение углеводами необходимо во время обработки холодом. Таким образом, хотя при низких температурах метаболизм у большинства растений значительно замедляется, не вызывает сомнения, что яровизация включает активные физиологические процессы, природа которых пока еще совершенно неизвестна. [c.360]

Общепринято для хранения нри низких температурах густые суспензии микроорганизмов в криозащитной среде, предохраняющей их от возможных повреждений, разливать (0,5—1,0 мл) в стеклянные или пластиковые ампулы или пробирки (флаконы) с завинчивающимися пробками. В небольших лабораториях в качестве криоагентов наиболее часто используют смесь льда или снега (3 г) с МаС1 (1 г), имеющую температуру —2 С смесь льда (2 г) с СаСЬ (1 г) с температурой —56 °С твердую углекислоту (—78 °С). Замораживание клеток ведется в сосудах Дюара. [c.151]

Результаты, полученные при двухступенчатом замораживании клеток, послужили основанием для пересмотра ряда криобиологических концепций в области представлений о механизмах криоповреждения и криозащиты. Поскольку в некоторых случаях двухступенчатое охлаждение обеспечивает более высокую сохранность клеток в данной криозащитной среде в сравнении с охлаждением при оптимальной скорости (выбранной по двухфакторной теории), Фаррант и сотрудники пришли к выводу о том, что скорость охлаждения лишь косвенно влияет на выживаемость консервируемых суспензий. [c.65]

Метод длительного хранения T.ferrooxidans предложен Манхе [167]. Суть его состоит в быстром замораживании клеток. T.ferrooxidans выращивают при 30 °С на среде с Fe при pH 1,6. При этом значении pH среды осаждение соединений Fe не прдасходит. Затем из пипетки по каплям 48—72-часовую культуру вносят в стеклянный сосуд, содержащий жидкий азот. Сосуд помещают в сетку из медной проволоки и погружают в блок с полистироловой пеной. Затем замороженные капли с культурой переносят в охлажденный сосуд объемом 2 мл, который закрывают и погружают в вакуумированный сосуд с жидким азотом при температуре от —120 до -180 С. [c.53]

Асцитные жидкости можно хранить в замороженном виде, но в этом случае отпадает необходимость в соблюдении стерильности (препараты будут использованы для последующих в/б инъекций), которая должна быть обеспечена при замораживании клеток для последующего культивирования in vitrp. После центрифугирования асцитной жидкости осадок ресуспендируют в PBS, а не в среде ГАТ. [c.147]

Нарушения адгезивных свойств клеток после криоконсервиро-ния были выражены в большей степени в случае применения качестве криопротектора глицерина при замораживании клеток трисутствии 10 % глицерина около 10 % клеток утрачивало способ-1Сть к прикреплению и распластыванию при использовании 10 % МСО — только 3%. Скорость адгезии также была ниже при пользовании в качестве криопротектора глицерина. [c.65]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология