Замораживание оттаивание клеток

Нередко для полного разрушения клетки требуются значительные усилия. Здесь может быть полезным, кроме механического разрушения, такое воздействие, как чередующееся быстрое замораживание и оттаивание. Нередко хорошие результаты дает быстрое замораживание в жидком воздухе или азоте с последующим измельчением замороженного препарата в ступке или фарфоровой мельнице. Для особо прочных клеток (например, некоторых бактериальных), а также для глубокого разрушения отдельных элементов животной клетки (например, митохондрий) рекомендуется обработка ультразвуком. Варьируя мощность источника и частоту колебаний, можно, как правило, подобрать режим воздействия, при котором не происходит денатурации извлекаемого белка. [c.15]

Клетки можно разрушить и физическими методами немеханическими (например, с помощью осмотического шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания) или механическими (обработкой ультразвуком, с помошью шаровой мельницы, гомогенизации под давлением, соударения). Обычно после обработки немеханическими методами многие клетки остаются неповрежденными. Напротив, механическое разрушение высокоэффективно, что делает его более привлекательным. Особенно часто ультразвуковые излучатели, генерируюшие высокочастотные звуковые волны, используют для обработки малых объемов. Клетки разрушаются при этом под действием гидродинамических сил (сдвига слоев жидкости друг относительно друга, кавитации и т. д.). [c.366]

Для успешного вьщеления ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при вьщелении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения pH, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений). [c.79]

Ферменты находятся в живой клетке либо в межклеточной жидкости — цитоплазме, либо в структурных образованиях клетки — ядре, оболочке, микросомах, митохондриях и др. Клеточные и субклеточные (для митохондрий) мембраны непроницаемы для молекул ферментов. Поэтому для извлечения внутриклеточных ферментов надо сначала разрушить клеточные структуры. Разрушение клеточных структур осуществляют различными механическими способами (измельчение в гомогенизаторе, перемалывание со стеклянными шариками, песком, кизельгуром, твердыми нейтральными солями), многократным замораживанием и оттаиванием, обработкой органическими растворителями (этиловым спиртом, бутиловым спиртом, ацетоном, глицерином, этилацетатом). В отдельных случаях для разрушения особо прочных клеток используют действие высокочастотных звуковых и ультразвуковых колебаний. [c.199]

Существует достаточно много способов разрушения клеток центрифугирование, замораживание-оттаивание, изменение осмотической силы раствора. Можно работать с грубой мембранной фракцией (клеточные мембраны, ядерные мембраны, мембраны цитоплазматических органел) или с конкретными мембранами. При отсутствии каких-либо предпочтений следует выбрать тот способ разрушения клеток, при котором специфическое связывание будет наилучшим образом совпадать с клеточным специфическим связыванием. Если на целых клетках наблюдаются высокие величины неспецифического связывания, то следует выбрать тот способ разрушения клеток, при котором неспецифическое связывание будет наименьшим. [c.474]

Клетки ресуспендируют в PBS (5-10 кл/мл) и проводят три цикла замораживания — оттаивания. [c.51]

Для определения продолжительности цикла размножения рабдовируса в культуре клеток вирус вносят в концентрации, достаточной для заражения всех клеток. После адсорбции вируса на монослое клетки отмывают от несвязавшегося вируса, добавляют предварительно нагретую культуральную среду и продолжают инкубацию при 37 °С. Через определенные промежутки времени в образцах зараженной культуры определяют содержание вируса. Для этого либо снимают клетки со стекла палочкой и разрушают их с помощью 3 циклов замораживания—-оттаивания (можно также один раз заморозить клетки при —60°С в бане из метанола и сухого льда и дать им быстро оттаять при 37°С), либо обрабатывают клетки I—2 мин ультразвуком, чтобы освободить вирус, ассоциированный с клетка- [c.113]

Клетки и клеточные структуры можно разрушить также путем повторного замораживания и оттаивания. При этом внутри клеток образуются кристаллы льда, вызывающие разрушение клеточных структур. В некоторых случаях для разрушения клеток используют ультразвук (действие высокочастотных звуковых колебаний). Однако ультразвук может вызвать частичную или полную потерю активности фермента. Для очистки ферментов от сопутствующих (балластных) веществ прибегают к различным приемам. Низкомолекулярные вещества могут быть удалены путем диализа. Этот прием пригоден для всех однокомпонентных ферментов и для тех двухкомпонентных ферментов, у которых оба составляющих компонента (белковый и небелковый) крепко связаны друг с другом и не расчленяются при диализе. [c.127]

Замораживание — оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах. [c.148]

Стадия 1. Разрушение клетки бактерии. Первой стадией почти всегда является разрушение клетки бактерий. Это достигается ультразвуковой обработкой (гл. 18) или последовательным замораживанием — оттаиванием для размягчения клеточной стенки с последующим перемешиванием в миксере с мелкими стеклянными шариками. После разрушения большинства клеток стеклянные шарики, неразрушившиеся клетки и клеточные стенки лдаляют центрифугированием. [c.219]

Клетки микроорганизмов разрушать труднее. Для этого используют ультразвук, высокое давление, замораживание— оттаивание, обработку определенными веществами и др. [c.101]

Отмирание микроорганизмов при замораживании с последующим оттаиванием объясняется превращением жидкой среды в лед и уходом воды из клетки, что приводит к обезвоживанию организма, вызывающего его гибель. [c.285]

Билипротеины (комплексы фикобилин-белок) экстрагируют из клеток красных и сине-зеленых водорослей, растирая их в воде или разбавленных солевых растворах в присутствии (в случае необходимости) абразивного материала. Клетки разрушают также путем глубокого замораживания сухим льдом и последующего оттаивания или же путем обработки метанолом или концентрированной соляной кислотой. Билипротеины обычно осаждают из водных экстрактов 40—75%-ным сульфатом аммония, отделяют центрифугированием, диализуют и затем хроматографируют. [c.269]

Разрушьте клетки тремя циклами замораживания и оттаивания в жидком азоте или в смеси сухого льда с этанолом. Можно также разрушить клетки ультразвуком или смешиванием с равным объемом октилового спирта (при 4 °С Б течение ночи) [c.121]

Образцы полученной клеточной линии следует хранить в замороженном состоянии. Около 5-10 клеток/мл суспендируют в среде, содержащей 20% сыворотки плода коровы или лошадиной сыворотки и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) по объему. Флаконы обертывают губчатой резиной или бумагой, чтобы создать условия для медленного замораживания. Продержав флаконы 24 ч при —70°С, переносят их в жидкий азот. При такой методике замораживания клетки после оттаивания всегда проявляют высокую жизнеспособность. Целесообразно также заморозить и клетки исходной,опухоли, чтобы сохранить образцы клеток с исходными свойствами. [c.388]

Одной из серьезных проблем, возникающих по мере па-лучения заготовок вирусов герпеса, является их очистка от клеточного материала, поскольку большая часть вируса тесно связана с клетками. Клетки разрушают, проводя ряд циклов замораживания и оттаивания, однако это может привести и к снижению титра вируса. Обработка клеток ультразвуком небезопасна из-за возможного образования аэрозолей, содержащих инфекционный вирус. Поэтому лучше всего проводить дезинтеграцию в ультразвуковой бане в закрытом сосуде. К сожалению, мы не можем рекомендовать какую-либо определенную марку ультразвукового дезинтегратора. Необходимо проверять эффективность каждого из них. Вирусные заготовки обрабатывают ультразвуком до полного разрушения клеток. [c.274]

Клонотеки, полученные с использованием бактериальных клеток, обычно хранят при -70°С в виде суспензии в 30% глицерине, а суспензии фаговых частиц - в диметилсульфоксиде, что предохраняет клетки и вирусные частицы от гибели при замораживании и оттаивании. Этой процедуры, впрочем, рекомендуется избегать для большей сохранности клонотеки и отбирать бактерии или фаговые частицы без оттаивания основной суспензии. В этой связи бывает полезно исходную клонотеку хранить отдельно, а на ее основе получить вторичную клонотеку, которую, разделив на несколько частей, использовать в повседневной работе, оттаивая каждую часть ограниченное число раз. [c.158]

ДНК можно ввести в бактерии также искусственно. Для этого, напр., бактерии кишечной группы (для них естественная Т. не характерна) охлаждают и обрабатывают растворами a lj или Rb l либо подвергают замораживанию при низких т-рах с последующим оттаиванием. Клетки при этом становятся проницаемыми для ДНК, однако механизм Т. в этом случае совершенно иной, чем описанный выше. [c.626]

М трис, 0,5 мМ Mg b, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы, pH 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки. Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания — оттаивания с последующим разведением. Клеточные оболочки, состоящие из наружной и внутренней мембран, получают центрифугированием при 27 ООО g в течение 20 мин. [c.148]

При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации. [c.137]

Микроорганизмы, выращенные на синтетической среде, обычно более чувствительны к действию различных стрессов, чем клетки, полученные на богатой питательной среде, содержащей сложные компоненты. Изменяя состав среды, можно подобрать условия, способствующие синтезу в клетках таких соединений, как гликогеноподобные резервные вещества, липиды, пептиды, которые защищают их от повреждений при замораживании — оттаивании. [c.152]

После криоконсервирования и хранения в жидком азоте клетки перевиваемых культур особенно нуждаются в оптимальных условиях культивирования, так как восстановление нелетальных повреждений, возникающих при замораживании—оттаивании, возможно только при благоприятных условиях. Установлено, что процессам восстановления способствует инкубирование клеток в среде, содержащей уабаин, или в среде с пониженным содержанием кислорода а также в кондиционированной среде [25—27]. Стимулирующее действие на пролиферацию клеток перевиваемых культур после криоконсервирования оказывает инсулин [14]. [c.66]

Для того чтобы понять, какие типы биохимических изменений могут создавать устойчивость или толерантность к замерзанию, мы должны сначала рассмотреть непосредственные причины повреждения клеток при образовании льда. Прежде всего внутриклеточное замерзание воды почти при любых обстоятельствах приводит к гибели клеток в результате необратимого разрущения их ультраструктуры. Выживание клеток после образования в них льда наблюдалось только в лабораторных условиях, когда к клеткам добавляли больщие количества криопротектантов, а замораживание и оттаивание производили с соблюдением строго определенного режима. В настоящее время, по-видимому, нет данных, которые указывали бы на возможность аналогичной толерантности к внутриклеточному образованию льда в природных условиях. [c.298]

Для того чтобы выделить фермент и дать возможно более полную характеристику его физических, химических и каталитических свойств, прежде всего следует выбрать объект, отличающийся высоким содержанием исследуемого фермента. Сейчас известно, например, что бобы канавалии содержат много уреазы, что батат богат р-амилазой, ячменный солод — а-амилазой, млечный сок папайи — папаином, клубни картофеля — фосфорилазой, листья сахарной свеклы — инвертазой, в щитке семян кукурузы содержится много рибонуклеазы и т. д. Для экстрагирования фермента необходимо разрушить цитоплазматическую мембрану клетки, а возможно, и клеточную оболочку. С этой целью применяют обработку материала с помощью пресса или в гомогенизаторе, растирание в ступке с песком, встряхивание при высоких скоростях с песком или стеклянными шариками, замораживание и оттаивание, а также высушивание ацетоном. При выделении [c.98]

По вопросу о формах соединений, в которых калий находится в растительной клетке, мнения противоречивы До недавнего времени в физиологии растений господствовали взгляды, согласно которым весь калий находится в клетке только в ионной форме. Недавно с помощью радиоактивного калия удалось показать, что в листьях бука около 30% всего калия находится в связанном состоянии (А. Олсен). По-видимому, речь должна идти об адсорбции калия белками цитоплазмы, так как связь эта не разрушалась даже после замораживания листьев и последующего их оттаивания. [c.422]

НЫХ оболочках бактериальных клеток или убитых нагреванием бактериях кроме того, они обрабатывали тем же ферментом бактерии, зараженные фагом Т2, а затем подвергнутые замораживанию и оттаиванию. При адсорбции фага на изолированных клеточных оболочках фаг инъецирует свою ДНК прямо в среду (по другую сторону клеточной оболочки). При заражении же бактерий, которые были либо убиты нагреванием до заражения, либо после заражения подвергнуты замораживанию и оттаиванию, оболочка бактериальной клетки становится проницаемой по отношению к молекулам ДНКазы. [c.265]

В. мертвых клетках после их оттаивания или в высохших после увлажнения вследствие некоординированного воздействия ферментов происходят гидролиз инулина и расщепление белков. Клетки становятся доступными воздействию микроорганизмов и начинают гнить. Процесс разложения мгртвой ткани сопровождается выделением тепла, что ведет к интенсификации процесса и образованию очагов гниения. Мерой предупреждения загнивания корней при хранении является отделение вялых и замороженных корней от здоровых и укрытие их, что предупреждает увядание осенью и излишнее охлаждение и замораживание корней зимой. [c.32]

Существует ряд методик, позволяющих более или менее успешно Делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов. Например, при обработке клеток Е. oli растворителями (толуолом или бензолом) они становятся проницаемыми для р-галактозидов, которые проникают в клетки и подвергаются гидролизу р-галактозидазой [4]. Растворители применяются также при определении фос-фоенолпируват-фосфотрансферазной системы у Е. oli [17]. Для обработки клеток используются также различные растворы толуола в этаноле. Иногда такая обработка сопровождается замораживанием и оттаиванием клеток [6]. [c.379]

Источником гемоглобина может служить любой образец свежей крови, обработанный антикоагулянтом. Для приготовления гемолизатов используют также капиллярную кровь. Осажденные эритроциты трижды промывают солевым раствором (3— 5-кратный объем по отношению к осадку). Гемолиз проводят в стеклянных пробирках, добавляя к клеткам 1—1,5 объема дистиллированной воды и 0,4 объема ССЦ. Смесь встряхивают 4 мин и центрифугируют. Прозрачную надосадочную жидкость затем фильтруют через фильтровальную бумагу и разбавляют до нужной концентрации [598, 753]. Лизис клеток можно ускорить, добавив после дистиллированной воды небольшое количество сапонина или путем их замораживания и оттаивания в дистиллированной воде. Однако обработка клеток вторым способом приводит к осаждению гемоглобина Н. Этот аномальный гемоглобин и некоторые другие нестабильные гемоглобины могут денатурироваться во время интенсивного встряхивания с ССи. Для предотвращения денатурации таких гемоглобинов содержащие их эритроциты лизируют в 4 объемах дистиллирован- [c.320]

Как правило, для наилучшего выживания клеток использу-. ются медленное замораживание и быстрое оттаивание клеток. Замораживание не должно быть слишком медленным, что облегчает рост кристаллов льда. При очень быстром замораживании не обеспечивается выход воды из клеток. Компромиссная скорость замораживания 1 С/мин достигается следующим путем. Клетки в коробке из пористого полистерола (толщина стенок около 1,5 см) помещают на 2 ч в охлаждающую среду с температурой —70 С, а затем переносят в жидкий азот. При температуре жидкого азота (—196 °С) клетки можно хранить в течение ряда лет без существенной потери жизнеспособности. Некоторые линии клеток, например клетки ВНКС13, могут храниться в течение многих месяцев при —70 °С, что очень удобно для постоянного использования клеток в лаборатории. [c.98]

Повторять последние 3 раза стадии каждые 3 дня, получая каждый раз чашки, являющиеся репликами исходной. Клетки на бумажных дисках сохраняют жизнеспособность и могут быть использованы для радиоавтографического анализа. С другой стороны, они могут быть лизированы замораживанием и оттаиванием и инкубированы в ферментативном тесте. Другим методом, приводящим к тому же результату, является посев мутагенизированных клеток в пластинку для микротитрования с 96 лунками, как для клонирования клеток. Когда колонии вырастут, клетки можно собрать и распределить между несколькими микротитровальными пластинками, используя ручные или автоматические сборщики клеток и разбавители, поставляемые Titertek (Flow Labs. Ltd.). [c.189]

Образовавшие осадок клетки разрушить озвучиванием или тремя циклами замораживания и оттаивания в бане лед/этанол. Осадить обломки клеток при 400д в течение 10 мин и аликвоты надосадочной фракции хранить при —70°С (ВИРУС, АССОЦИИРОВАННЫЙ С КЛЕТКАМИ). [c.200]

Левит объяснил гибель растительных клеток в процессе замораживания следующим образом. Избирательно проницаемая плазматическая мембрана (2) растительной клетки (рис. 23) располагается под жесткой, хорошо проницаемой для разных веществ клеточной оболочкой (У) и частично связана с ней. Поэтому в гипертоническом растворе, когда клетка обезвоживается, область Л плазматической мембраны, не связанная с клеточной стенкой, подвергается растяжению. Растяжение мембраны, по мнению Левита, влечет за собой появление разрывов в липидном слое, вследствие чего оказывается возможным контакт белков, расположенных по обе стороны этого слоя, и образование прочных дисульфидных связей зиежду ними. Если таковые возникают, то после оттаивания аномальные связи между белками, которые находятся во внешнем и внутреннем монослоях мембраны, сохраняются, а целостность липидного слоя не восстанавливается. Этим объясняется утрата плазматической мембраной свойства избирательной проницаемости после замораживания. Кроме того, в соответствии с указанными представлениями в процессе замораживания образуются прочные дисульфидные связи между белками мембран и прилегающими к ним белками плазмы, что ведет к необратимому повышению жесткости поверхности мембраны. Из-за этого при реаккумуляции воды клетками мембрана растягивается хуже, чем в процессе обезвоживания, что может привести к ее разрыву на этапе отогрева. В пользу выдвинутой Левитом гипотезы свидетельствует понижение содержания 5Н-групп в растениях, подвергнутых ХОЛОДОВОЙ закалке , по сравнению с незакаленными . [c.54]

Этот метод (многократное замораживание, например, в ванне с Ж идким азотом, и оттаивание, например, в теплой воде) —быстрый, удобный, относительно дещевый — позволяет обрабатывать одновременно большое количество биомассы и дает легко воспроизводимые результаты, однако имеет свои ограничения. Клетки, разрушаемые таким способом, должны обладать не очень прочной стенкой или не содержать ее, а интересуемые внутриклеточные компоненты должны быть относительно стабильны к подобного рода обработке, не подвержены денатурации и защищены от протеолиза. [c.138]

Разведения культуральной жидкости из обработанных мутагеном культур титруют методом бляшек после осветления, но без замораживания и оттаивания. Для этого на клетки наносят необходимые разведения и инкубируют клеткц под [c.158]

Повреждения клеток при замораживании и последующем оттаивании зависят, с одной стороны, от образования льда внутри их, а с другой — от их дегидратации. Опасен рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0.1 мкм), чьи грани разрушают эндомембраны [6]. Скорость роста кристаллов сильно возрастает при увеличении степени переохлаждения воды. Полностью рост и перестройка кристаллов льда прекращаются в чистой воде только около —140 °С [7]. Вот почему длительное уверенное хранение возможно только при более низких температурах. Точка замерзания цитоплазмы около —1 °С, проникающие криопротекторы понижают ее в соответствии со своим —например, для 10%-ного ДМСО = =—3.5 °С [8], но клетки обычно остаются незамерзшими до —10 —15 °С, так как до этих температур плазмалемма еще предотвращает проникновение внутрь кристаллов льда, растущих во внешнем растворе [7]. Следовательно, к моменту инициации кристаллизации в клетке уже существует значительное переохлаждение, что очень неблагоприятно. Но если температура снижается достаточно медленно, то свободная вода успевает выйти из клетки, замерзая на поверхности кристаллов в растворе [7]. Происходит значительная дегидратация и сжатие протопласта. Возникающие повреждения могут иметь различные механизмы [9], но ведущую роль для клеток растений, если внутри них не образуются большие кристаллы льда, при снижении температуры до —25 °С и ниже играет чрезмерный [c.70]

Клетки (5 10 —10 10 ) после промывания в фосфатно-солевом буфере суспензируются в 0.3—0.5 мл 0.01 М Трис-НС1, pH 7.5. После трехкратной процедуры замораживания в жидком азоте с последующим оттаиванием и центрифугирования в пробу добавляется сахароза (хч) до концентрации 10 %. Состав геля 5 %-ный (для ЛДГ) или 7 %-ный (для Г6ФДГ) акриламид ( Serva ), [c.102]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология