Замораживание для разрушения клеток

Нередко для полного разрушения клетки требуются значительные усилия. Здесь может быть полезным, кроме механического разрушения, такое воздействие, как чередующееся быстрое замораживание и оттаивание. Нередко хорошие результаты дает быстрое замораживание в жидком воздухе или азоте с последующим измельчением замороженного препарата в ступке или фарфоровой мельнице. Для особо прочных клеток (например, некоторых бактериальных), а также для глубокого разрушения отдельных элементов животной клетки (например, митохондрий) рекомендуется обработка ультразвуком. Варьируя мощность источника и частоту колебаний, можно, как правило, подобрать режим воздействия, при котором не происходит денатурации извлекаемого белка. [c.15]

Клетки можно разрушить и физическими методами немеханическими (например, с помощью осмотического шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания) или механическими (обработкой ультразвуком, с помошью шаровой мельницы, гомогенизации под давлением, соударения). Обычно после обработки немеханическими методами многие клетки остаются неповрежденными. Напротив, механическое разрушение высокоэффективно, что делает его более привлекательным. Особенно часто ультразвуковые излучатели, генерируюшие высокочастотные звуковые волны, используют для обработки малых объемов. Клетки разрушаются при этом под действием гидродинамических сил (сдвига слоев жидкости друг относительно друга, кавитации и т. д.). [c.366]

Для успешного вьщеления ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при вьщелении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения pH, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений). [c.79]

Ферменты находятся в живой клетке либо в межклеточной жидкости — цитоплазме, либо в структурных образованиях клетки — ядре, оболочке, микросомах, митохондриях и др. Клеточные и субклеточные (для митохондрий) мембраны непроницаемы для молекул ферментов. Поэтому для извлечения внутриклеточных ферментов надо сначала разрушить клеточные структуры. Разрушение клеточных структур осуществляют различными механическими способами (измельчение в гомогенизаторе, перемалывание со стеклянными шариками, песком, кизельгуром, твердыми нейтральными солями), многократным замораживанием и оттаиванием, обработкой органическими растворителями (этиловым спиртом, бутиловым спиртом, ацетоном, глицерином, этилацетатом). В отдельных случаях для разрушения особо прочных клеток используют действие высокочастотных звуковых и ультразвуковых колебаний. [c.199]

Существует достаточно много способов разрушения клеток центрифугирование, замораживание-оттаивание, изменение осмотической силы раствора. Можно работать с грубой мембранной фракцией (клеточные мембраны, ядерные мембраны, мембраны цитоплазматических органел) или с конкретными мембранами. При отсутствии каких-либо предпочтений следует выбрать тот способ разрушения клеток, при котором специфическое связывание будет наилучшим образом совпадать с клеточным специфическим связыванием. Если на целых клетках наблюдаются высокие величины неспецифического связывания, то следует выбрать тот способ разрушения клеток, при котором неспецифическое связывание будет наименьшим. [c.474]

Температура, при которой должна происходить сушка, является весьма спорным вопросом. Если образец находится при низкой температуре, то рекристаллизация уменьшается, но время сушки становится нереально долгим. Тем не менее маленькие образцы, такие, как одиночные клетки, первоначально высушивались замораживанием при 173 К, после чего в течение трехнедельного периода температура постепенно повышалась. Сушка при более высокой температуре повышает риск рекристаллизации льда, но приводит к более быстрому удалению воды, н это является более приемлемым с практической точки зрения подходом. Лиофильная сушка при более высоких температурах также повышет риск разрушения (коллапса) растворимой матрицы с сопутствующей потерей структурной целостности образца. Явление коллапса характерно для многих водных растворов, и наилучшим образом его можно избежать лишь при лиофильной сушке маленьких образцов при низких температурах 444]. Парадоксальной здесь является большая вероятность коллапса при тонкой структуре замороженных областей— той структуре, которая нам нужна, но которую редко получают прн быстром охлаждении биологической ткани. В большинстве процессов лиофильной сушки замораживание производится в интервале температур между 213 и 203 К, и при таких условиях монослой клеток высыхает в течение нескольких часов, в то время как высушивание кусочка ткани толщиной в несколько миллиметров может занять несколько дней. Хотя не существует единственного режима лиофильной сушки, который можно было бы одинаково хорошо применять ко всем образцам, имеется целый ряд практических рабочих соображений, которые могут быть использованы для всех образцов. [c.298]

Клетки и клеточные структуры можно разрушить также путем повторного замораживания и оттаивания. При этом внутри клеток образуются кристаллы льда, вызывающие разрушение клеточных структур. В некоторых случаях для разрушения клеток используют ультразвук (действие высокочастотных звуковых колебаний). Однако ультразвук может вызвать частичную или полную потерю активности фермента. Для очистки ферментов от сопутствующих (балластных) веществ прибегают к различным приемам. Низкомолекулярные вещества могут быть удалены путем диализа. Этот прием пригоден для всех однокомпонентных ферментов и для тех двухкомпонентных ферментов, у которых оба составляющих компонента (белковый и небелковый) крепко связаны друг с другом и не расчленяются при диализе. [c.127]

К первому типу относятся такие явления, как 1) чрезмерное осмотическое обезвоживание клеток, в результате которого уве-ллчивается концентрация внутриклеточных веществ, приводящая к высаливанию и необратимой денатурации растворимых белков или к повреждению мембранных структур из-за потери обеспечивающей их нормальное состояние доли воды 2) разрушение клетки за счет контакта с омывающей кристаллы льда средсгй., концентрация растворенных веществ в которой из-за превраще -ния части растворителя в лед непрерывно увеличивается вплоть до эвтектической области 3) резкое изменение кислотности иг ионной силы растворов вне и внутри клеток в процессе замораживания 4) повреждение клеточной мембраны вследствие до<-стижения клеткой минимального объема. [c.57]

Стадия 1. Разрушение клетки бактерии. Первой стадией почти всегда является разрушение клетки бактерий. Это достигается ультразвуковой обработкой (гл. 18) или последовательным замораживанием — оттаиванием для размягчения клеточной стенки с последующим перемешиванием в миксере с мелкими стеклянными шариками. После разрушения большинства клеток стеклянные шарики, неразрушившиеся клетки и клеточные стенки лдаляют центрифугированием. [c.219]

Эффект фазы роста культуры. Как видно из приведенных на рис. 3.2 данных, образование антител продолжается даже после того, как клетки перестали пролиферировать. Было высказано обоснованное предположение, что синтезированные антитела не сразу секретируются клетками в культуральную среду [35 ]. Позднее, в фазе отмирания, клетки лизируют и высвобождают находящиеся в них антитела. Полученные результаты побудили провести специальные эксперименты по определению содержания антител в клетках в фазах роста и отмирания. Оказалось (рис. 3.3), что количество антител, которые удается выделить из гибридомных клеток после их разрушения с помощью замораживания - размораживания, в течение всех фаз роста практически постоянно и слишком мало, чтобы можно было объяснить наблюдае- [c.43]

При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации. [c.137]

Одной из серьезных проблем, возникающих по мере па-лучения заготовок вирусов герпеса, является их очистка от клеточного материала, поскольку большая часть вируса тесно связана с клетками. Клетки разрушают, проводя ряд циклов замораживания и оттаивания, однако это может привести и к снижению титра вируса. Обработка клеток ультразвуком небезопасна из-за возможного образования аэрозолей, содержащих инфекционный вирус. Поэтому лучше всего проводить дезинтеграцию в ультразвуковой бане в закрытом сосуде. К сожалению, мы не можем рекомендовать какую-либо определенную марку ультразвукового дезинтегратора. Необходимо проверять эффективность каждого из них. Вирусные заготовки обрабатывают ультразвуком до полного разрушения клеток. [c.274]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология