Библиотеки космидные, создание

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Поскольку именно космидная библиотека является основой нашей работы, мы решили подробно описать здесь ее создание. [c.33]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

По-видимому, наиболее подходящие для этого векторы-космиды или даже искусственные хромосомы дрожжей (YA ) (разд. 9.6. в). В компьютерном банке данных уже имеются физические карты протяженных участков двух небольших эукариотических геномов aenorhabditis elegans и S. erevisiae. Для построения таких карт из геномных библиотек, созданных с помощью фага 1. или космидных векторов, случайным образом отбирают большое число длинных клонированных фрагментов. Размеры фрагментов, которые получаются из каждого клонированного сегмента при его расщеплении ограниченным набором рестриктаз, систематизируют. Созданы специальные компьютерные программы, которые позволяют сравнить разные наборы фрагментов и выявить, какие из клонов, скорее всего, содержат перекрывающиеся геномные области. В настоящее время уже 95% генома нематоды (размер гаплоидного генома 8 Ю" п.н.) представлено перекрывающимися клонированными сегментами. У дрожжей более 95% генома (размер гаплоидного [c.351]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология