Конъюгат пероксидазой

Конъюгат пероксидазы хрена с антигеном [c.136]

Увеличение времени инкубации далеко не всегда приводит к повышению чувствительности определения. В каждом случае необходимо проверять, происходит ли при более длительной инкубации дальнейшее развитие окраски или ее ослабление, особенно в случае проведения реакции при повышенной температуре. Для уяснения вероятности ослабления окраски в ходе ферментативной реакции смесь стандартов с конъюгатом [пероксидаза — IgG] после завершения начальной фазы превращения субстрата длительно инкубировали при 25 и 37 °Q. Как видно на рис. 12-7, после 30 мин инкубации при 37 развитие окраски практически прекращается, в то время как при 25 С на этом же этапе окраска продолжает интенсивно нарастать. [c.181]

Рисунок 21. Определения малых количеств человеческой ДНК методом гибридизации биотинилированного олигонуклеотида с образцами иммобилизованной ДНК. Визуализация образовавшегося ассоциаты происходит путем связывания с биотином конъюгата Пероксидазы хрена со Стрептавидином и дальнейшего окисления хромогена ТМВ.

Добавить 30 мл предварительно нагретого Отмывающего раствора и 180 мкл конъюгата (Пероксидаза хрена — стрептавидин). Инкубировать на водяной бане-шейкер при -1-50ОС ( 1°С) при 50-60 об/мин. в течение 10 минуг ( 1 мин.). После инкубации раствор слить. [c.194]

Растворяют 0,25 г очищенной п-оксифенилпропионовой кислоты в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 8,0 (pH раствора смещается до 7,0). Приготовленный раствор субстрата добавляют в лунки микроплат (по 0,25 мл), содержащие иа стенках специфически сорбированные конъюгаты пероксидазы, иккуби-руют 5 мин при 30 °С и инициируют реакцию добавлением 0,05 мл 0,03%-ной Н2О2. Через 10—60 мин инкубации при 30 °С реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции образцов (X возбуждения 320 нм, испускания — 405 им). [c.72]

Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить 1) доступностью фермента в очищенном виде 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры [c.133]

Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG по методу Накане. [c.183]

Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG с помощью SPDP. [c.189]

Рис. 2.9. Применение ELISA для тестирования специфичности антисыворотки к IgG человека. В лунках панели адсорбирован антиген (2,5 мкг/мл) ряды А и В —IgG человека, С и D —IgM человека, Е и F —IgA человека (все антигены получены из нормальной сыворотки) G и Н —легкие цепи х. Исследуемая сыворотка добавлена в двукратных последовательных разведениях (начиная с 1 100) от вертикального ряда 2 до ряда 12 (ряды А и В) или до вертикального ряда 9 (другие горизонтальные ряды). Лунки вертикальных рядов 10—12 (ряды С—Н) содержат разведения антисывороток, специфичных к адсорбированным на дне этих лунок антигенам. В реакции использовали конъюгат пероксидазы хрена с кроличьей антисывороткой к IgG овцы. Вертикальный ряд 1—контроль (только конъюгат). Исследуемая антисыворотка взаимодействует только с IgG человека. Реакция в лунках рядов G и Н идет вследствие примеси IgG, обнаруженной в препаратах >с-цеси, т. е. метод позволил определить и чистоту антигена

Конъюгаты пероксидазы с антителами получали по описанному ранее методу ( hen et al., 1984), представляющему собой модификацию тиол-малеимидного метода (Yoshitake et al.. 1979). [c.134]

Определение морфия. Индикаторную полоску, содержащую антитела против морфия (10 мкг/см ) и глюкозооксидазу (4 мМЕ/см ), погружают в 2 мл образца (буферного раствора или мочи) и инкубируют 1 мин. Переносят полоску в 2 мл проявителя (содержащего в 1 л 0,1 моль фосфата натрия 0,2 моль хлорида натрия 2 г бычьего сывороточного альбумина, 300 мг 4-хлорнафтола 50 ммоль глюкозы 0,25 г тритона QS-44 300 мг конъюгата пероксидазы с морфием), встряхивают 3—5 с и выдерживают 1() мин. Вынимают полоску, промокают ее для удаления остатков жидкости и измеряют интенсивность окраски с помощью отражательного спектрофотометра марки Ma beth . Следует отметить, что анализ по существу не зависит от объема образца или проявителя важно только, чтобы они полностью покрывали поверхность полоски. Все стадии анализа проводят при комнатной температуре. [c.134]

Как показано на рис. 10-2, активную поверхность индикаторной полоски образуют антитела против морфия, иммобилизованные совместное глюкозооксидазой на подложке из целлюлозы. На первой стадии анализа полоску погружают в жидкий образец. Центры связывания на антителах заполняются молекулами антигена, причем степень заполнения пропорциональна его концентрации. Затем полоску переносят в проявляющий раствор, содержащий конъюгат [пероксидаза—морфий], глюкозу и хромогенный субстрат пероксидазы (4-хлорнафтол).При инкубации с проявителем конъюгат связывается с вакантными центрами на иммобилизованных антителах и катализирует окисление 4-хлорнафтола пероксидом водорода, генерируемым иммобилизованной глюкозооксидазой, с образованием нерастворимого голубого продукта, который остается на поверхности полоски. Через 10 мин визуально или с помощью отражательного спектрофотометра определяют интенсивность окраски. [c.136]

По окончании этой стадии полоску целиком погружают в проявитель. Иммунологически связанный конъюгат пероксидазы катализирует окисление 4-хлорнафтола пероксидом водорода, выделяющимся в реакции глюкозы с Ог под действием глюкозооксидазы. При этом образуется нерастворимый голубой продукт, прилипающий к полоске. Хотя пероксид водорода выделяется равномерно вдоль всей полоски, окрашенный продукт появляется только на тех участках, где локализован конъюгат пероксидазы с антигеном. Применение системы детектирования, основанной на сопряженных ферментативных реакциях, позволяет обходиться без сравнительно нестойких проявителей, содержащих пероксид водорода. Окраска формируется за 5 мин, при этом появляется цветная зона или ракета с остроконечным фронтом, высота которого зависит от концентрации антигена в образце (рис. 10-15). [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология