Галактозидаза дигоксина

Рис. 15-2. Кинетика связывания дигоксина (0,2 нмоль) с конъюгатом [Fab — -галактозидаза] ( 10 нмоль).

ВХОДИТ несколько молекул моновалентных антител, неизбежно ограничивает чувствительность определения до значений, характерных для конкурентных методов. Это обусловлено невозможностью отделения полностью свободных антител от би- или поливалентных антител, у которых хотя бы один из центров связывания остался свободным —и те, и другие будут связываться с сорбентом. В то же время в ряде случаев требования к чувствительности определения антигена таковы, что их вполне удается удовлетворить с использованием немономерных конъюгатов [фермент — моновалентные антитела], особенно при наличии антител с высоким сродством к антигену. В качестве примера можно отметить разработку на основе ИААК чувствительного (нижний предел обнаружения 0,2 нМ) и очень точного (коэффициент вариации меньше 3%) автоматизированного метода определения дигоксина (Leflar et al., 1984). В этом случае для детектирования использовали немономерный конъюгат типа [F(ab )s — р-галактозидаза]. [c.247]

Хотя, строго говоря, метод ИААК должен быть отнесен к классу гетерогенных ИФА, этап разделения связанных и свободных реагентов в этом методе осуществляется настолько просто и быстро (особенно при использовании соответствующего оборудования), что позволяет сопоставить его с современными вариантами гомогенного анализа. Время инкубации после добавления к образцу препарата моновалентных антител, конъюгированных с ферментом, определяется главным образом концентрациями антител и антигена, поскольку их взаимодействие в данном случае представляет собой простую обратимую бимолекулярную реакцию, зависящую только от диффузии. В табл. 15-1 представлены результаты расчета скорости взаимодействия антиген — антитело в зависимости от их относительного содержания в реакционной смеси. Единственным допущением при расчетах является величина константы скорости прямой реакции ЫО л моль -с выбранная на основании данных, полученных для большинства исследованных систем взаимодействия небольших антигенов с антителами (Pe ht, 19 2). Из расчетных данных табл. 15-1 следует, что даже для определения тестируемого компонента, концентрация которого не превышает пикомолярного уровня, использование большого избытка конъюгата [фермент—антитело] (на наномолярном уровне) позволяет ожидать быстрого количественного связывания и завершения анализа не более чем за 5—10 мин. Кривая, построенная на основании изучения кинетики связывания дигоксина с мономерным конъюгатом [Fab — -галактозидаза] (рис. 15-2), подтверждает справедливость расчетных оценок. Концентрации дигоксина и конъюгата в этих экспериментах составляли 0,2 нМ и 10 нМ соответственно. Как видно на ри- [c.249]

Данные, представленные на рис. 15-3, отражают влияние скорости потока на эффективность анализа. Они были получены для определения дигоксина с использованием мономерного конъюгата [Fab — -галактозидаза] и колонок (0,5x2 см) с аффинным сорбентом [сефадекс G-10 — сывороточный альбумин человека — уабаин] (об использовании уабаина вместо дигок- [c.251]

Получение конъюгата [фермент — гаптен]. Присоединение ДСА-МБ к -галактозидазе осуществляют так же, как это описано для Т4 в разделе, посвященном ИФА Т4. К 1,5 мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,5 мг -галактозидазы (0,93 нмоль), добавляют раствор ДСА-МБ ТГФ (0,2 мг/мл, 10 нмоль). Смесь инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После диализа в течение ночи против того же фосфатного буфера смесь очищают хроматографией на колонке (1,5x40 см) с сефадексом G-25. Для анализа дигоксина используют фракции с максимальной ферментативной активностью. [c.269]

Для ИФА дигоксина осуществляли связывание малеимидного производного дигоксигенин-З-О-сукцината с -галактозидазой. При этом с производным гаптена связывалось около 97% фермента. После завершения реакции конъюгации снижения ферментативной активности не наблюдалось. Результаты, полученные в случае ИФА дигоксина, сходны с результатами тестирования других гаптенов. Антисыворотку разводили в 5000 раз и 0,1 мл разведенного раствора использовали для стандартного анализа. При проведении ИФА с вытеснением [c.272]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология