Аффинные сорбенты

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. [c.11]

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [c.11]

До настоящего времени аффинный сорбент не использовали повторно, но если разработать метод элюирования белка без фотолиза, так чтобы сорбент можно было снова использовать, то это откроет путь широкому применению этому адсорбционному методу для очистки В12-зависимых ферментов. [c.395]

Комплекс легко расщепляется в слабокислой среде, а также под действием конкурирующих диолов — этиленгликоля и 1,3-пропан-диола. Путем закрепления фенилборной кислоты на матрице можно получить аффинный сорбент, с помощью которого РНК с незамещенной по 2-му и 3-му гидроксилам концевой рибозой легко отделить от [c.373]

КОМПОНЕНТЫ АФФИННОГО СОРБЕНТА МАТРИЦЫ [c.342]

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Аффинные сорбенты с] групповой специфичностью в некоторых случаях не уступают по избирательности сорбентам с индивидуальной специфичностью, а иногда даже имеют свои преимущества. Так, [c.362]

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В12, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В12-зависимых ферментов или В12-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину В12. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один нз наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки М-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеин1юбаламинмстилтрапс-феразы из Е. oli. [c.394]

РАЗРАБОТКА НОВОГО АФФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЛИЗИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА [c.67]

Поэтому мы начнем изложение с краткой характеристикп используемых в настоящее время компонентов аффинных сорбентов матриц, лигандов и спейсеров. Одновременно рассмотрим способы соединения их между собой, ограничившись только теми немногими пз большого числа вариантов, испробованных и описанных в прошлом десятилетии, которые выдержали проверку временем. Впрочем, к ним имеет смысл добавить два-три только что предложенных способа, обещающих какие-то новые преимущества. Затем можно будет проанализировать более подробно параметры и характерные особенности процесса аффинной хроматографии и на основании этого анализа сформулировать некоторые рекомендации по практической постановке эксперимента. [c.342]

Целью работы было создание нового аффинного сорбента с иммобилизованной л<-аминофенилбороновой кислотой (л<-АФБК) на основе широко применяемого в биохимии полиакриламидного геля (ПААГ) для определения гликолизированного гемоглобина в крови человека. [c.67]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Разработка нового аффинного сорбента для определения гликолизированного гемоглобина [c.186]

В отличпе от сефадексов и обычной сефарозы, пористость сшитой сефарозы практически не лсеняется при переходе от водных растворителей к органическим. При этом она устойчива к пх воздействию, что облегчает проведение разнообразных химических реакций замещения с целью получения аффинных сорбентов. Вместе с тем отметим, что активация сефарозы L бромистым цианом (для присоединения аффинных лигандов) происходит с вдвое более низкой эффективностью, чем в случае обычной сефарозы. Это объясняется тем, что сшивка идет по тем же самым гидроксилам, что и активация с помощью Br N. [c.120]

Разумеется, для многих частных, а иногда и довольно общих случаев эта задача решена или облегчена усилиями фпрм, выпускающих аффинные сорбенты. Номенклатура их непрерывно расширяется, и некоторые справочные данные о продажных обменниках приведены ниже. Тем не менее каждый исследователь, понимающий исключительные возможности аффинной хроматографпп, должен быть готов к тому, чтобы сконструировать, хотя бы с помощью простейших из доступных способов, аффинный обменник для решения своей особой задачи. [c.342]

Шестичленные алифатические спейсеры не отличаются высокой степенью гидрофобности, и все же следует пметь в виду возможность различного рода нежелательных явлений, обусловленных такой гидрофобностью. Например, известны случаи ложной биоспецифичности связывания фермента с аффинным сорбентом, когда попытки очистки на таком же сорбенте фермента с такой же биологической специфичностью, но полученного из другого объекта кончались полной неудачей. Причина, как оказалось, состояла в различии гидрофобных свойств поверхностей белковых молекул вдали от активных центров этих ферментов, а связывание одного из них носило гидрофобный характер [О Сагга et al., 1974]. Те же авторы описали интересное яв- [c.358]

Аффинный сорбент с групповой специфичностью пмеет явное преимущество в том случае, когда ставится задача не только очистки, но и разделения нескольких веществ, наделенных сродством к одному и тому же лиганду. Если степень этого сродства не одинакова для разных веществ группы или если удается подобрать для них различные (специфические) конкурентные элюенты, то разделение веществ люжет быть осуществлено хроматографически, в ходе пх поочередной элюции с сорбента, что не удалось бы сделать в случае лиганда, обладающего сугубо индивидуальной специфичностью. С позиций очистки одного вещества это же положение дел можно сформулировать следующим образом снижение избирательности сорбции ири использовании сорбентов с групповой специфичностью часто удается компенсировать за счет избирательности аффинной конкурентной элюции. [c.363]

Не удивительно поэтому, что популярность и сфера применения аффинных сорбентов с групповой специфичностью в последние годы быстро увеличиваются, а вместе с ними растет и список таких сорбентов, поставляемых в готовом виде. Нам необходимо познаколгать-ся с торговылш наименованиями, особенностями и областями использования важнейших из них. Не будем загромождать изложение их техническими характеристиками (емкость, пористость, рабочий диапазон pH). Иногда эти параметры будут очерчиваться самой сферой применения сорбентов во всяком случае, их нетрудно найти в каталогах фирл1, которые мы упомянем. Рубрикация дальнейшего изложения построена по наименованиям самих лигандов. [c.363]

Перед использованием колонки с аффинным сорбентом ее имеет смысл промыть раствором бычьего сывороточного альбумина (2 мг/мл). Было замечено, что в результате этого улучшается качество очистки и фракционирования методом конкурентной элюции целого ряда ферментов. По-видимому, БСА блокирует на сорбенте места неспецифической сорбции ферментов [Ramadoss et al., 19831. [c.368]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Естественно, что еще более эффективную, чем с гепарином, и избирательную очистку белков метаболизма и регуляции матричной активности можно получить, используя в качестве лигандов сами нуклеиновые кислоты. Аффинные сорбенты с иммобилизованными НК могут обладать не только групповой (белки хроматина, нуклеазы, рестриктазы и др.), но и сугубо индивидуальной снецифично- [c.370]

Недавно фирма Pier e начала выпуск аффинного сорбента для очистки гликопротеидов под названием Gly o-Gel В , в котором борная кислота закреплена непосредственно на матрице 6 %-ной агарозы. [c.374]

Теперь можно вернуться к процедуре посадки лиганда на матрицу. После окончания инкубации необходимо блокировать не использованные в реакции с лигандом активные группы матрицы. Для этого сорбент переносят в 1 М раствор этанола.мина или 0,2 М раствор глицина при pH 8 и снова перемешивают, как при посадке лиганда. Наконец, для удаления избытков лиганда и блокирующих агентов гель промывают на воронке 4—5 раз попеременно кислым и щелочным буферами, например 0,1 М Na-ацетатным (pH 4) и буфером. используемым для посадки лиганда, добавляя в оба буфера до 0,5 М Na l. Чередование pH при промывке способствует десорбции неспецифическп сорбированного на матрице материала. Промытый аффинный сорбент переводят в буфер для хроматографии и хранят на холоду. [c.377]

Мы столь подробно разобрали и проиллюстрировали методику использования Br N-активированной сефарозы, потому что этот вариант приготовления аффинных сорбентов в настоящее время пользуется наибольшей популярностью. Теперь рассмотрим (менее детально) способы использования других готовых активированных матриц. [c.379]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология