Антитела свободные

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

Другим перспективным направлением в разработке амперометрических биосенсоров является создание устройств, основанных на иммунологических реакциях. Принцип иммунного анализа заключается во взаимодействии исследуемого вещества, называемого антигеном (АГ), со специфически связывающимся с ним антителом (АТ) с образованием комплекса АГ -АТ. При фиксированной концентрации антитела (антигена) равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена (антитела) зависит от его общей концентрации. Таким образом, неизвестную концентрацию антигена (антитела) можно определить при помощи фиксированного количества меченых антител (антигенов). Для этого антиген или антитело метят ферментами. Разработанные к настоящему времени иммуноферментные амперометрические датчики можно классифицировать следующим образом [c.506]

Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

Интересным развитием идеи использовать ферментные метки является контроль соотношения связанный свободный> путем изменения активности фермента в результате связывания в конъюгат с антителом или дополнительного связывания антиферментных антител. Такие способы анализа не нуждаются в этапе разделения, а значит, можно упростить проведение определения. Разработано несколько способов гомогенного ферментативного иммунного анализа (ФИА). [c.595]

Для определения положения равновесия между свободными антителом и антигеном и их комплексом или между антителом и гаптеном и их комплексом использовали различные методы. Среди них — метод равновесного диализа (I), прямой анализ преципитатов и надосадочной жидкости (II), электрофорез и ультрацентрифугирование (III) и метод рассеяния света (IV). Эти эксперименты подробно описаны в цитированных работах. Здесь мы можем только сказать, что все это методы определения или расчета концентраций свободных антител, свободных антигенов, свободных гаптенов и их комплексов в состоянии равновесия. На основе таких измерений можно вычислить константу равновесия К и AF°. Если эти измерения произвести при нескольких значениях температур, можно определить также величины ДЯ° и А5°. [c.166]

Для заполнения колонки смолу суспендируйте в PBS промойте колонку для удаления нековалентно связавшегося антигена. Для предотвращения возможного загрязнения элюируемых антител свободным антигеном проводите элюцию буфером с высокой ионной силой (например, содержащим [c.167]

Зона эквивалентности количества антигена достаточно для связывания и осаждения всех имеющихся антител свободные антигены и антитела в супернатанте отсутствуют. [c.527]

Осаждение иммуноглобулинов легко осуществить высаливанием при нейтральном pH, при котором они малорастворимы, так что в случае меченого антигена связанную метку можно осадить из раствора вместе с оставшимся свободным антителом, оставляя, таким образом, свободную метку на поверхности. В качестве соли предпочитают использовать сульфат аммония, но недостатком метода в таком случае является высокий уровень неспецифического связывания. [c.577]

Антитела можно использовать для идентификации зародышей свертывания. Другой путь поиска следов структуры в несвернутых полипептидных цепях состоит в расщеплении нативных полн-пептидных цепей и в проверке с помощью специфичных антител, который из фрагментов принимает свою нативную конформацию. Большинство из этих экспериментов было выполнено на нуклеазе стафилококка [418 453) они показали, что фрагменты величиной от 17 до 120 остатков свертываются в нативную конформацию с константой равновесия К = [N]/[R]a 10 . Согласно уравнению (3.2), это отвечает невыгодному изменению свободной энергии приблизительно на 4 ккал/моль. В принципе этот метод можно использовать для поиска зародышей свертывания для этой цели необходимо выделить или синтезировать необходимые фрагменты полипептидной цепи [454]. Стабильные фрагменты, которым соответствуют высокие значения К, наиболее вероятно представляют нуклеации свертывания. [c.185]

Результаты количественной реакции преципитации можно выразить графически, построив кривую зависимости количества азота преципитата от количества добавляемого антигена. Полученную кривую можно разделить на три части. Первая часть кривой — зона избытка антител. В соответствующих пробирках комплексы антиген — антитело образуют преципитат, который осаждается центрифугированием, а в надосадочной жидкости можно обнаружить свободные молекулы антител. Вторая часть кривой (ее вершина) — зона эквивалентности. Надосадочная жидкость в соответствующих пробирках не содержит ни свободного антигена, ни свободных антител. Третья часть кривой — зона избытка антигена надосадочная жидкость в соответствующих пробирках содержит несвязанные молекулы антигена. С увеличением количества добавляемого антигена количество азота преципитата начинает уменьшаться. Дальнейшее увеличение концентрации антигена может привести к еще большему растворению преципитата вплоть до полного перехода его в раствор. [c.126]

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделение комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген, либо антитело иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или антител с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в химическом анализе. [c.114]

Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время тер >ган гомогенный иммуноанализ применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [c.115]

В конкурентном иммунном анализе устанавливают число центров, не занятых пробой он может иметь различные варианты, но суть в том, что определяемое вещество пробы смешивают с меченым определяемым веществом, и они конкурируют за активные центры (рис. 7.9-4). Метсд требует разделения связанного и свободного антигена или антитела с целью определения их относительных количеств. Если определяют антиген, присутствие меченого антигена позволяет оценить относительное разделение. Как можно заключить из кривых иа рис. 7.9-3, оптимальная чувствительность достигается при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела. [c.569]

Если система настолько инертна, что не происходит никакого смещения равновесия во время ультрацентрифугирования, то для каждой осаждающейся формы образуются раздельные границы, и, в принципе, можно получить равновесные концентрации из соответствующих граничащих областей. Сингер и сотрудники использовали этот метод для получения концентрации свободного антигена в растворах растворимых комплексов антиген — антитело [66, 69, 70]. Однако необходима большая осторожность при объяснении измерений в системах, в которых происходит частичное смещение равновесия во время седиментации и последующее расширение границ [70]. [c.386]

Применяя гормон, связанный с полилизином, можно получить антисыворотку, специфичную к декапептиду ангиотензину. Если инкубировать такую сыворотку с ангиотензином, содержащим радиоактивную метку, а затем хроматографировать на сефадексе G-25, то можно установить, что он элюируется вместе с сывороточными белками и при этом объем выхода равен свободному объему (Kav = 0). Однако если постепенно увеличивать количество неактивного ангиотензина, то все большая часть радиоактивной метки будет обнаруживаться в низкомолекулярной области Kav = ) Такое поведение явно свидетельствует о присутствии в применяемой сыворотке специфического антитела. [c.149]

Полученные данные наносят на график, где по оси абсцисс откладывают АВсв (антитела, связанные с антигеном), а по оси ординат — отношение АТсв к АТсвоб (антитела свободные). Через полученные [c.324]

Принципиальное значение имеет вопрос о функции лимфоцитов, содержащих на своей поверхности адсорбированные иммуноглобулины (антитела) или комплексы антиген-антитело. Как показано в гл.1, при иммунизации в селезенке быстро накапливается большое число клеток, способных связывать антиген, использованный для иммунизации. Их число в селезенке мыши, иммунизированной гетерологичными эритроцитами, достигает 2— 2,5% от общего числа ядерных клеток селезенки. Затем в течение 3—4 дней число этих клеток снижается в 10 раз. Такая кинетика антигенсвязывающих лимфоцитов дала основание предположить (А. Кульберг и др., 1974), что большая их часть принадлежит к клеткам, сорбировавшим на своей поверхности комплексы антиген-антитело. В составе сорбированных комплексов часть активных центров антител свободна и сорбированные комплексы за их счет связывают антиген. Проверка этого предположения была осуществлена Б. Юриным с соавторами (1976, 1977). Очищенные лимфоциты селезенки мышей культивировали in vitro в течение 20 ч. Клетки получали на 5-й и 9-й дни после иммунизации эритроцитами барана. Пятый день соответствует максимальному содержанию в селезенке лимфоцитов, связывающих антиген, а 9-й — времени резкого снижения их содержания. Через различные сроки после начала культивирования определяли число лимфоцитов, связывающих эритроциты барана (антиген) и общее содержание иммуноглобулинов на поверхности клеток, с помощью радиоиммунно-го анализа (см. гл. 12). Часть проб культивировали в присутствии циклогексимида — ингибитора биосинтеза белка. [c.148]

Р. knowlesi (возбудитель малярии обезьян) в культуре, на что указывают данные по включению Н-лейцина. Размножение плазмодия подавляется на стадии, следующей за разрывом шизонтов вышедшие из них мерозоиты не могут проникнуть в новые эритроциты. Активность иммунной сыворотки может снижаться в результате предварительной абсорбции специфичных антител свободными шизонтами. [c.352]

Видно, что при фиксированной концентрации антитела равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена зависит от его общей концентрации. Этот вывод лежит в основе всех иммунохимических методов. По существу антитела выступают в роли реагентов биологического происхождения, которые с высокой специфичностью способны узнавать чужеродные вещества. Обычно они представляют собой иммуноглобулины - белки сыворотки крови, которые образуются в ответ на введение иммуногена. Однако многие ни комолекулярные соеданения, в том числе и пестициды, сами по себе не стимулируют обргиование антител, т е. не являются иммуногенами. Индуцировать их образование можно лишь после связывания этих веществ с белком-носителем, в качестве которого, как правило, применяют бычий альбумин. Следует заметить, что в реакции с белком-носителем не должны затрагиваться те группировки молекул антигена, которые участвуют в образовании комплексов антиген-антитело и которые, следовательно, необ.ходимы для индуцирования образования в организме животного специфических антител. [c.298]

В качестве маркеров применяют также ферменты. Основгшная на этом принципе специальная аппаратура для высокочувствительного ферментативного иммунохимического анализа выпускается серийно. В этом случае определяемый компонент метят ферментом. С антителами взаимодействуют как свободные, так и связанные с ферментом соединения, причем активность фермента при образовании комплексов АГ-АТ. как правило, подавляется (иногда усиливается). Концентрацию исследуемого вещества определяют путем измерения активности фермента по отношению к соответствующему субстрату. Чем больше концентрация немаркированного соединения, тем меньше фермента связьшается антителами и тем выше его активность. При этом достигается высокая чувствительность определений, характерная для ферментативных методов анализа. Использование ферментов-маркеров для контроля за ходом иммунохими- [c.299]

В иммунном анализе определяемое вещество не связано с продуктом каталитической реакции, а является меткой, маркирующей наличие комплексного или свободного антигена илн антитела. Основы иммунного анализа обсуждаются в разд. 7.9. Так же, как в ферментативных тест-наборах (например, для определения глюкозы), на основе иммунного анализа создано большое число тест-наборов например, в тесте на беременность — хотя здесь результат рассчитан на наблюдение пользователя за развитием о1фаски и не контролируется автоматически (т. е. детектором служит человеческий глаз ). На такой тест-полоске [c.551]

Определяя общую концентрацию антител [АЬобщ] как сумму концентраций связанных [АЬ-А ] и свободных [АЬ] антител [c.566]

Контролируемый сигнал для связанного (АЬ2ь) и свободного (АЬ2/) меченого антитела должен различаться. Обычно измеряют связанное антитело, так что уравнение 7.9-13 означает, что будет полезным использовать избыток АЬ2, при котором соблюдаются условия [c.572]

Разделение связанной и свободной фракций можно провести различными способами. В жидкофазном анализе растворов используют осаждение, центрифугирование и декантацию, но они дают весьма непостоянные результаты и поэтому не нашли широкого применения. Первый большой успех в этом направлении сделали Майлс и Хейлс (1968), которые предложили удалять несвязанные меченые антитела, вводя большой избыток антигена в твердой фазе (рис. 7.9-7). [c.574]

Преимущество использования в качестве метки кофактора фермента, а не самого фермента, заключается в том, что его можио легко включить в схему усиления (рис. 7.9-17) н испольэовать в системе гомогенного анализа. Применяют конъюгаты гаптен-кофактор (например, NAD-гaпт н), и в присутствии соединения фepмeнт-NAD и субстрата конъюгат, связанный с антителом, неактивен, тогда как свободный конъюгат способен участвовать в ферментативном цикле. Каждый раз, когда конъюгат гаптен-кофактор претерпевает цикл уси- [c.596]

Никаких доказательств того, что процесс образования пятен и шапочки имеет какое-то отношение к стимуляции синтеза антител, не существует. Тем не менее зтот процесс интенсивно изучается, поскольку, возможно, полученные при зтом сведения помогут понять причины высокой подвижности связанных иммуноглобулинов и других рецепторов в клеточных мембранах. Существует предположение, чтО рецепторные молекулы (например, гликофорин) проходят через мембрану и связываются с цитоскелетом , образованным микрофиламента-ми и микротрубочками [97]. Рецептор, находясь в одном из состояний, должен быть свободным, чтобы диффундировать в плоскости мембраны с образованием пятен , зтот процесс не требует затраты знергии. В другом состоянии рецептор должен быть связан с микрофиламента-ми и микротрубочками, движения которых могли бы обеспечивать процесс образования шапочки , требующий знергии. В некоторых случаях инициация синтеза антител в лимфоцитах может происходить при связывании лектинов. Поскольку структура конканавалина А и характер его связывания с углеводными группами (разд. В 3) уже известны, мы надеемся, что исследование взаимодействия лектинов с клеточными поверхностями приблизит нас к пониманию сложных процессов, лежа щих в основе ответа на антиген [98, 99]. [c.386]

Для определения концентрации гормона смешивают меченный, например ИОДОМ-125, гормон с антителами к данному гормону. Образуется комплекс — гормон—антитело. При добавлении исследуемого экстракта немеченный гормон, находящийся в исследуемом растворе, конкурирует с меченым в реакции связывания с антителом, вытесняя последний из комплекса. Далее освобождеиный гормон отделяют от связанного электрофорезом, хроматографией или осаждением и количественно определяют его, измеряя радиоактивность. Из полученных данных можно рассчитать количество исследуемого немеченого гормона, так как радиоактивность свободного гормона зависит от того, насколько много меченого гормона было вытеснено из комплекса антиген — антитело. Более подробно с этим вопросом можно ознакомиться по литературе [582, 591]. [c.240]

Синтезированный из проинсулина инсулин может существовать в нескольких формах, различающихся по биологическим, иммунологическим и физико-химическим свойствам. Различают две формы инсулина 1) свободную, вступающую во взаимодействие с антителами, полученными к кристаллическому инсулину, и стимулирующую усвоение глюкозы мышечной и жировой тканями 2) связанную, не реагирующую с антителами и активную только в отношении жировой ткани. В настоящее время доказано существование связанной формы инсулина и установлена локали- [c.268]

Перекисно модифицированные ЛПНП, образовавшись в артериальной стенке, быстро и бесконтрольно захватываются здесь макрофагами. Иногда модифицированные изменения липопротеинов заходят настолько глубоко, что липопротеины приобретают аутоантигенные свойства, к ним вырабатываются антитела и в конечном счете образуются аутоиммунные комплексы липопротеины—антитела. Последние также обладают высокой ате-рогенностью и бесконтрольно захватываются артериальными макрофагами. Макрофаги, захватившие модифицированные липопротеины или иммунные комплексы (липопротеин—антитело), накапливают в цитоплазме чрезвычайно высокие концентрации эстерифицированного и свободного холестерина (в них нет энзимов, которые расщепляли бы холестерин) и трансформируются в так называемые пенистые клетки. Последние в результате цитотоксического действия высоких концентраций холестерина погибают, при их разрушении во внутреннюю оболочку артерий изливается ими же накопленный холестерин. Поэтому пенистая клетка рассматривается как главная виновница атеросклеротического процесса на морфологическом уровне. [c.406]

На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между гликопротеином оболочки вируса мол. массой 120 кДа (gpl20) и рецептором на поверхности Tj -клеток - D4 (рис. 10.16, А). In vitro поражение Tj -клеток блокируется антителами к D4 процесс замедляется также при избытке свободного белка D4. Однако ни один из этих способов не приводит к [c.222]

Декстраны обладают антигенными свойствами их иммунохимические реа <ции подробно изучены . Количественное исследование ингибирования реакции антидекстрановой сыворотки с декстранами под действием олигосахаридов позволило установить предельные размеры детерминантной группы углеводного антигена. Оказалось, что максимальные размеры такой группы соответствуют гексасахариду, причем уже в случае трисахарида изменение свободной энергии при связывании с антителом составляет 90% от максимального. [c.548]

Принцип РИА основан на конкурентном связывании идентичных лигандов и антитела. В случае РИА оценивается конкуренция с радиоактивномеченым лигандом (обозначим его как 1 ). Меченый и немеченый лиганды конкурируют друг с другом за связывающий центр на лигандспецифичном антителе АВ свободные компоненты связанные компоненты [c.316]

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, по-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biote h (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе [c.541]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

Агрегация молекул инсулина часто затрудняет его точную идентификацию при гель-хроматографии тем не менее в подходящем растворителе с помощью теля декстрана удалось, например, выделить кристаллический инсулин из одного экземпляра рыбы [37], из 10— 20 г поджелудочной железы быка [38] и из одной железы кошки [39]. Инсулин, меченный 1г (см., напри-Мер, [40]), служит для обнаружения взаимодействия антигена с антителом. Комплекс, образующийся в сыворотке, был отделен от свободного инсулина на сефадексе 0-75 [41]. С помощью хроматографии на сефадексе 0-200 было показано, что имеется по крайней мере две белковые фракции, с которыми связывается инсулин [42]. Ингибитор инсулина из альбуминовой фракции был частично очищен в препаративных масштабах [43]. С другой стороны, наблюдалось, что часть [c.216]

Ингвал и др. [324] применилн принцип радиоиммуноанализа, описанный для определения кроличьего иммуноглобулина G однако вместо меченных радиоактивным изотопом антигенов они конъюгировали последние с ферментом — щелочной фосфатазой. Основой конкурентного иммуноаналнза является разделение свободных и связанных с антителами антигенов, так чтобы антигены можно было определить количественно. Это разделение можно облегчить фиксацией антител на твердой фазе путем физической сорбции на стенках полистирольных пробирок. [c.382]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология