Интеины

Несмотря на то, что биологическое значение сплайсинга белков до сих пор остается невыясненным, сам он уже находит применение в биотехнологии. Имеются, по крайней мере, две области применения интеинов. При одном подходе используют мутантные формы интеинов, у которых произведена замена Asn —> Ala в С-концевой части, что делает возможным прохождение только первого этапа сплайсинга. В таких системах рекомбинантные белки, синтезируемые в виде гибридных полипептидов с модифицированным интеином, отщепляются с участием тиольной группы в результате внутримолекулярной реакции трансэтерифика-ции (рис. 40). В итоге происходит высокоспецифическое протео-литическое освобождение рекомбинантного белка от предшественника, что облегчает его последующую очистку. Причем в процессе такого освобождения могут быть получены а-тиоэфир- [c.312]

Рис. 40. Освобождение целевого белка из рекомбинантного предшественника, содержащего интеин, и его спонтанное лигирование с другим пептидом по механизму EPL [45

Мутационная замена Asn Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена ( BD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a- ys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков [c.314]

Рис. 41. Транс-сплайсинг белка с использованием разделенного интеина [45]

Полипептидную цепь интеина можно разделить на две части, N-концевую (1 ) и С-концевую (1 ), которые сами по себе не обладают способностью осуществлять белковый сплайсинг, но после нековалентного объединения активируются [c.315]

Недавно несколькими независимыми группами исследователей была продемонстрирована возможность разделения интеинов на две части, каждая из которых сама по себе не обладает ферментативной активностью, однако после нековалентного их объединения комплекс активируется [64-67]. На основе этого открытия были разработаны высокоэффективные системы, осуществляющие транс-сплайсинг белков (рис. 41). При одновре- [c.315]

В заключение этого раздела следует упомянуть о возможности использования транс-сплайсинга белков для исследования белок-белковых взаимодействий в цитозоле прокариотических и эукариотических клеток [72, 73]. При таком подходе получают гибридные рекомбинантные белки путем слияния половинок зеленого флуоресцирующего белка (GFP) или люциферазы с двумя фрагментами расщепленного интеина. Другой конец одного из фрагментов интеина соединяют с белком-рецептором (приманкой), как это делается в классических системах дигибридного скрещивания у дрожжей, а у другого фрагмента - с большим количеством потенциальных белков-лигандов. В том случае, если между рецептором и лигандом происходит взаимодействие, два фрагмента интеинов объединяются друг с другом (см. выше, рис. 41) и осуществляют транс-сплайсинг, завершающийся образованием полноценного флуоресцирующего белка или люциферазы, что легко обнаруживается по изменению уровня флуоресценции инкубационной смеси. [c.316]

Явление сплайсинга существует и у оелкос (см. обзор Belfort et al., 1995). В процессе белкового сплайсинга из полипеп-тидных цепочек удаляются нефункциональные олигопептидные вставки (интеины). [c.36]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология