Гибридный полипептид

Все аффинные метки, составленные из аминокислотных последовательностей, можно разделить на две группы. К первой группе относятся небольшие пептиды, которые оказывают минимальное влияние на основной белок. Такие метки не иммуно-генны, и во многих случаях не возникает необходимости их удаления из гибридных полипептидов. Влияние коротких последовательностей на свойства основных полипептидов зависит от первичной структуры метки и положения в полипептидной цепи рекомбинантных белков [157]. Вторая группа аффинных меток включает большие пептиды или белки. Их использование способствует повышению растворимости основного белка, однако [c.126]

Протеогликан. Гибридная макромолекула, состоящая из олиго- или полисахарида, присоединенного к полипептиду, причем полисахарид представляет собой основной компонент молекулы. [c.1017]

Однако вряд ли отсутствие взаимодействия между субъединицами характерно для всех олигомерных ферментов. Кооперативные эффекты, свойственные некоторым регуляторным ферментам (гл. 8), по-видимому, объясняются именно таким взаимодействием с этим же связан и феномен межаллельной комплементации (гл. 10 и работа [5278]), который лежит в основе восстановления каталитической активности. Для выяснения степени гетерологических взаимодействий были исследованы также искусственные гибридные ферменты, которые образуются при ассоциации нативных и модифицированных химическими методами полипептидов [1543] или при ассоциации субъединиц, полученных от разных видов [3561]. [c.109]

Как описано в разд. 4.1, гибридные белки состоят из бактериального или синтетического полипептида, связанного с эукариотическим полипептидом. Обычно бывает нужно выделить только эукариотический белок. Для этого используется следующий подход. Конструируют гибридный ген, в продукте которого имеется точка расщепления, расположенная между участком цепи, кодируемым бактериальной иЛи искусственно синтезированной последовательностью, и участком, кодируемым последовательностью эукариотического гена. Было описано множество подходов, решающих проблему расщепления, которые грубо можно разделить на два типа химические и ферментативные (табл. 4.5). Выбор конкретного подхода определяется свойствами чужеродного белка, идеальная ситуация — это возможность использования сайта расщепления, отсутствующего в последовательности чужеродного белка. [c.104]

Гибридные белки можно конструировать таким образом, что их выделение в чистом виде упрощается. В этом случае бактериальные или синтетические нуклеотидные последовательности, присоединенные к эукариотическому гену, кодируют полипептиды, которые избирательно присоединяются к определенным реагентам, используемым для хроматографии. Б трех примерах, приведенных в табл. 4.11, гибридные белки сконструированы с расчетом на их выделение с помощью аффинной хроматографии. Как схематично изображено на рис. 4.7, для осуществления этого процесса нужно использовать следующую методику. [c.112]

Получение -глобина из гибридного белка, синтезированного в клетках Е. соИ, — пример процесса очистки полипептида, находящегося в денатурированном состоянии [23]. [c.123]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Несмотря на то, что биологическое значение сплайсинга белков до сих пор остается невыясненным, сам он уже находит применение в биотехнологии. Имеются, по крайней мере, две области применения интеинов. При одном подходе используют мутантные формы интеинов, у которых произведена замена Asn —> Ala в С-концевой части, что делает возможным прохождение только первого этапа сплайсинга. В таких системах рекомбинантные белки, синтезируемые в виде гибридных полипептидов с модифицированным интеином, отщепляются с участием тиольной группы в результате внутримолекулярной реакции трансэтерифика-ции (рис. 40). В итоге происходит высокоспецифическое протео-литическое освобождение рекомбинантного белка от предшественника, что облегчает его последующую очистку. Причем в процессе такого освобождения могут быть получены а-тиоэфир- [c.312]

Адресная доставка гибридных белков. Адресные домены (tagging domains) и сигнальные последовательности белков широко используются в белковой инженерии для направленного изменения внутриклеточной и внеклеточной локализации гибридных полипептидов. Разработано большое количество векторов, в том числе и коммерческих, которые позволяют с помощью простых генно-инженерных манипуляций получать гибридные белковые [c.378]

Во-вторых, использование схемы а приводит к образованию гибридного, или слитого (fusion) полипептида, в котором чужеродная для клетки, но целевая для исследователя аминокислотная последовательность располагается на С-конце молекулы. Как правило, чужеродный белок в гибридной форме нефункционален, но его антигенная структура сохраняется. Таким образом, для некоторых аналитических целей гибридный полипептид может быть использован. Чтобы получить чужеродный белок в индивидуальной форме, его отщепляют от гибридного полипептида с помощью специфических эндопептидаз и других реагентов (табл. 10.2). Например, в векторе M13mpllFX клонирована последовательность [c.331]

Существование внутригенной комплементации на самом деле не снижает основной ценности определения гена, данного Бензером. Ее легко объяснить, исходя из представления о четвертичной структуре белков. Как мы уже видели в гл. IV, многие белки осуществляют свою биологическую функцию лишь в том случае, если они находятся не в виде отдельной полипептидной цепи, а в составе четвертичной структуры, образованной из двух или большего числа полипептидных цепей. Так, мы уже упоминали, что Р-галактозидаза представляет собой агрегат, состоящий нз четырех идентичных полипептидных цепей. Рассмотрим теперь /5-мутацию в гене, определяющем белок, который проявляет свою ката-.литическую активность, лишь находясь в форме комплекса, построенного из четырех идентичных полипептидных цепей. В этом случае мутантный фенотип 1з, очевидно, возникает в результате появления в одном из участков мутантной полипептидной цепи неподходящей аминокислоты. Вследствие этого интервал температур, в котором агрегат, состоящий из четырех цепей, может принимать физиологически активную четвертичную структуру, оказывается суженным. Это значит, что, хотя при пермиссив-ной температуре 25 °С такой агрегат сохраняет свою активность, при 42 °С он денатурирует. Допустим теперь, что в одной и той же клетке присутствуют две копии гена, определяющего рассматриваемый белок, и, как в цис-транс-тесте, эти копии несут разные мутации. Тогда должны возникнуть гибридные агрегаты мутантного белка, из четырех полипептидов которого часть синтезирована под контролем одного, а часть — под контролем другого /5-мутантного гена. В этом случае существует возможность, что интервал температур, в котором гибридный мутантный агрегат образует функционально активную структуру, окажется шире интервала температур для образования функционально активных агрегатов, состоящих только из одного типа мутантных полипептидов. Это значит, что два разных замещения аминокислот в первичной структуре белка, вызванные двумя й-мутациями, могут привести к взаимной компенсации. В результате такой компенсации агрегат из мутантных полипептидов, так же как и белок дикого типа, сохраняет стабильность в широком интервале температур. [c.314]

По своим свойствам гибридные тетрамеры занимают промежуточное положение между соответствующими гомотетрамерами. Эти свойства часто бывают близки к среднеарифметическим свойствам составляющих полипептидов, откуда следует, что между субъединицами отсутствует кооперативное или ан-тикооперативное взаимодействие. Аналогичная картина наблюдается для алкогольдегидрогеназы млекопитающих этот фермент также кодируется несколькими генными локусами. Так, алкогольдегидрогеназа печени лошади — димер, существующий в трех изоформах Ег, Е5 и 82 [1223]. Полипептид 5 окисляет стероиды, а также этанол и ацетальдегид. Свойства гибридного димера Е5 являются приблизительно среднеарифметическим между свойствами форм Е2 и 82 [3684, 3685]. [c.109]

Те сравнительно немногие белки, которые кодируются собственными геномами этих органелл, расположены в основном во внутренней мембране в митохондриях и в тилакоидной мембране в хлоропластах. Полипептиды, кодируемые геномами этих органелл, обычно образуют субъединицы белковых комплексов, другие компоненты которых кодируются ядерными генами и поступают из цитозоля. Образование таких гибридных белковых агрегатов требует сбалансированности синтеза этих двух типов субъединиц каким образом координируется синтез белка на рибосомах разных гипов, разделегшьгх двумя мембранами, остается загадкой. [c.29]

Гибридные гены можно конструировать таким образом, что детерминируемые ими чужеродные белки будут локализоваться в цитоплазме клеток Е. oli либо, если лидерную последовательность встроить перед кодирующей, будут секретироваться наружу через клеточную мембрану. Как правило, когда рекомбинантные полипептиды остаются в клетке, они накапливаются в больших количествах (до 25% от суммарного белка клетки), чем когда они секретируются клеткой (менее 1 % суммарного белка клетки). Однако многие полипептиды, экспрессируемые в цитоплазму, образуют малорастворимые агрегаты [1J, и в этом случае для работы с ними требуются специальные методы их перевода в растворимое состояние. [c.95]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

В случае полипептидов, не содержащих метионина, для образования составного белка обычно используют метиониновую сшивку, которую в будущем можно расщепить бромистым цианом. Одним из примеров такого подхода служит присоединение р-галактозидазы к А-и В-цепям инсулина [11] соответствующая методика приведена в табл. 4.7. Гены гибридных белков, содержащих А- и В-цепи, клонированы и экспрессируются по отдельности. Перед расщеплением бромистым цианом агрегировавшие белки инкубировали в 6 М гуанидинхлориде и 1%-ном (объемная концентрация) 2-меркаптоэтаноле. Такая обработка должна приводить к развертыванию молекул гибридных белков и ослаблению всех имеющихся внутримолекулярных или межмоле-кулярных дисульфидных связей. Опять же такая предварительная обработка может оказаться необходимой, чтобы связь ме-тионин-Х стала доступной для расщепления. [c.106]

Как правило, гибридные белки конструируются таким образом, чтобы они содержали уникальные точки расщепления. Так, например, в кальцитонине нет остатков аргинина, и, следовательно, можно осуществить расщепление, катализируемое клострипаином, не рискуя расщепить заодно и эукариотический полипептид. [c.108]

Полипептиды небольших размеров, синтезируемые в клетках В. соИ в виде нерастворимых гибридных белков, также приходится переводить в растворимую форму, но тш,ательное определение условий их ренатурации не обязательно. Типичный пример — -эндорфин [10] этот полипептид, по-видимому, спонтанно ренатурирует либо в процессе его выделения из гибридного белка (табл. 4.9), либо в ходе очистки при экстракции стеклянным порошком. Кальцитонин человека — полипептид, который состоит из 32 аминокислот и включает два остатка цистеина, образующие в биологически активной молекуле дисульфндную связь. При разделении гибридного белка (табл. 4.8) отделенный от бактериального полипептида кальцитонин находится в двух формах восстановленной и окисленной, которые можно обна- [c.122]

Известны примеры эукариотических полипептидов, продуцируемых в клетках Е. oli в виде растворимых гибридных или обычных белков [1]. В некоторых случаях в растворенном состоянии находится только часть полипептида остальной белок входит в состав нерастворимых включений. Многие процедуры очистки, описанные для таких белков, предусматривают стадию аффинной хроматографии это либо иммунологические методы очистки, либо аффинная хроматография с использованием субстрата [1]. [c.128]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Несколько раз в инфицированных клетках наблюдали пептидно-расщепленный NS2 [77, 128, 178, 257, 268] позднее на основании его пептидного строения и штаммоспецифических различий при миграции в ПААГ было показано, что NS2 представляет собой вирускодируемый уникальный полипептид. Эти наблюдения привели к предположению, что один сегмент вирионной РПК кодирует два белка [139]. NS2 транслируется с отдельной маленькой мРНК [111, 134], а эксперименты по гибридно-остановленной трансляции и анализ рекомбинантов определенного геномного строения выявили, что NS2 закодирован 8-м сегментом РНК [111, 134] fia основании оценок размера 8-го сегмента РНК, размеров двух [c.55]

Клетки Е. соИ, содержащие гибридные плазмиды, несуш,ие такую вставк). способны синтезировать полипептид с биологической активностью интерферона Эта активность нейтрализуется антисывороткой к человеческому лейкоцитарному интерферону. Выход антивирусной активности в экстрактах клеток составил 10 1000 ед/мл (10 —10 ед/л), т. е. меньше одной молекулы на клетку, но сам факт синтеза активного полипептида был качественным шагом вперед. [c.192]

Кальмодулин-связывающий пептид. Очистка гибридных белков, содержащих кальмодулин-связываюпщй пептид, была впервые описана в 1992 г. [169]. В ней используется 26-звенный пептид, заключенный в С-концевой последовательности киназы легкой цепи миозина скелетных мышц. Кальмодулин в присутствии ионов Са2+ обладает высоким сродством к этому пептиду. Прочность комплекса допускает промывку колонки при аффинной хроматографии в жестких условиях, что позволяет достигать высокой степени очистки целевого полипептида. Система особенно пригодна для очистки рекомбинантных белков из клеток Е. соН, поскольку их собственные белки не взаимодействуют с кальмодулином. При этом хроматографию можно проводить в присутствии восстанав-ливаюпщх агентов и детергентов в концентрациях до 0,1%. Эта аффинная последовательность позволяет вводить радиоактивную метку с помопдью у-[32Р] и протеинкиназы А, что используется для исследования белок-белковых взаимодействий [170]. Данную аффинную последовательность предпочтительнее вводить в С-конец исследуемого полипептида, поскольку его N-концевая локализация часто приводит к ингибированию трансляции. [c.130]

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, клонотеки пептидов, полученные генно-ин-женерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Недавно сделанные наблюдения позволяют рассматривать клонотеку пептидов одновременно и в качестве клонотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образующиеся между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую клонотеку пептидов - как клонотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов. [c.338]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридный полипептид: [c.438] [c.139] [c.123] [c.132] [c.334] [c.381] [c.357] [c.217] [c.217] [c.933] [c.110] [c.266] [c.107] [c.107] [c.109] [c.117] [c.158] [c.159] [c.165] [c.176] [c.247] [c.191] [c.116] [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология