Концентрирование белковых растворов с помощью сефадекса

Перед проведением электрофореза слой воды с поверхности геля удаляют либо с помощью тонкой капиллярной пппетки, либо путем центрифугирования в течение 2 мин при наименьшей эффективной скорости. Поскольку концентрированные белковые растворы могут забивать поры в геле, целесообразно предварительно фракционировать белки перед электрофорезом. Для этого используют, например, слой сефадекса G-200 или G-100 [601]. На гель наносят желаемый буферный раствор, затем в него добавляют суспензию сефадекса на высоту 1—2 мм и капилляр центрифугируют для того, чтобы сефадекс осел на [c.108]

Реактивация фермента. Прежде всего с помощью гидролиза в мягких условиях снимают ацильные группы модифицированных аминокислот. Раствор белка разбавляют вдвое 0,2 М трис-ацетатным буфером (pH 8,1). При содержании белка <1 мг/мл в раствор добавляют бычий сывороточный альбумин до суммарной концентрации белка 1 мг/мл. Раствор осторожно титруют при комнатной температуре насыщенным (при 23 С, 100%-ное насыщение) сульфатом аммония, подкисленным до pH 2 концентрированной серной кислотой. Белок начинает выпадать в осадок при pH ,6,5. Суспензию выдерживают при pH 4,6 и комнатной температуре в течение 30—60 мин. а затем центрифугируют при 28 ООО и 4 °С в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в охлажденном до 4 X буфере следующего состава 100 мМ калнйфосфат (pH 8,5)+ 10 мМ дитиотрент+0,5 мМ калий ЭДТА+Ю мкМ флавинмононуклеотид. Небольшая примесь бычьего сывороточного альбумина (0,1 мг/мл) способствует растворению осадка. Сульфат аммония удаляют с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 в указанном буфере. Обессоленный образец (1—2 мг/мл) инкубируют в буфере для реактивации при 25 °С. [c.60]

С помощью сухого сефадекса Г-25 (крупнозернистый) можно концентрировать растворы высокомолекулярных веществ. Для эюго суспендируют сухой порошок сефадекса в концентрируемом растворе до образования густой мас сы При этом увеличивается концентрация макромолекул в растворе (белки, нуклеиновые кислоты, вирусы), так как они неспособны проникнуть в гранулы геля Концентрация электролитов в растворе мало меняется, потому что их коэффициент распределения между гелевой фазой и внешним раствором близок к единице. Через 10 минут набухшие гранулы геля отделяют центрифугированием в стаканах с сеточными адаптерами или осторожно отфильтровывают на воронке Бюхнера. Таким образом, можно сконцентрировать раствор в 10—20 раз при выходе высокомолекулярных веществ более чем 90%. Процедуру концентрирования можно повторить добавлением новой порции сухого сефадекса или диализом против сухого сефадекса Г-200. Эту простую и быструю процедуру выдерживают даже очень лабильные биополимеры, так как ионная сила раствора и pH остаются неизменными [285, 327]. Так, Л. К. Меньших [63] успешно применила подобную про-Ц РУ для концентрирования вируса гриппа из аллантоисной жидкости. [c.141]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология