ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ

Выделение риккетсий на культуре ткани. Клинический материал в объеме 0,5 мл смешивают с таким же количеством среды для культуры ткани и сразу же вносят в ячейки специальных планшетов или контейнеры, где предварительно выраш,ивают монослой соответствуюш,ей культуры клеток. Планшет центрифугируют в течение 1 ч при 700 g, после чего инокулюм удаляют, тщательно промывают ячейки с монослоем фосфатным буфером, вносят в них среду МЕМ с 10 % телячьей сыворотки крови и инкубируют при 34 °С в атмосфере 5 % СОз. Через 48 и 72 ч культуральную жидкость сливают, монослой промывают, фиксируют и окрашивают соответствующими люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ) для обнаружения возбудителя в клетках монослоя. При люминесцентной микроскопии обнаружение четырех и более характерно светящихся микроорганизмов расценивается как положительный результат. Идентификацию выделенных риккетсий проводят также методом ПЦР с амплификацией генов, специфичных для риккетсий (например, гена цит-ратсинтазы, белка 17 кДа, ОтрВ — для определения родовой принадлежности, белка ОтрЛ — для выявления риккетсий сыпного тифа). [c.236]

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Ход работы. Крысу декапитируют, фиксируют на препаровальном столике и вскрывают брюшную полость. При помощи канюли, соединенной резиновой трубкой с делительной воронкой, заполненной охлажденной средой пер-фузионного раствора, печень перфузируют до полного удаления видимых следов крови в вытекающей из печени жидкости. Затем извлекают печень, вырезают участки соединительной ткани и после просушивания на фильтровальной бумаге измельчают материал ножницами и пропускают через размельчитель типа поршневой мясорубки. Полученную массу взвешивают и смешивают с пятикратным (по массе) избытком среды выделения. Материал гомогенизируют путем многократного перемещения тефлонового пестика сверху вниз и наоборот. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология