Трансляция экспрессирующие векторы

Рис. 7.17. Двухцистронный экспрессирующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (а 3). Они разделены сегментом ДНК, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рибосом. Каждый ген находится под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Трансляция мРНК начинается с 5 -конца и с внутреннего сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъединицы объединяются с образованием функционального димерного белка. Вектор содержит сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ orf) и в клетках млекопитающих (orF y, селективный маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. соИ селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

Приведенные примеры четко демонстрируют роль двух основных факторов, оказывающих влияние на уровень экспрессии чужеродных клонированных генов, находящихся в составе экспрессирующих векторов в бактериальных клетках. Этими факторами являются, во-первых, оптимальная транскрипция клонированных генов и, во-вторых, эффективная трансляция транскрибированной мРНК. В обоих случаях наилучшие результаты могут быть получены при объединении в составе вектора структурной части клонированного чужеродного гена с генетическими элементами, регулирующими транскрипцию и трансляцию (промоторы, SD-последовательности и т.п.) бактериальных клеток-хозяев или их вирусов. Знание главных принципов, лежащих в основе регуляции транскрипции и трансляции, позволяет конструировать новые регуляторные последовательности (например, промотор Taq) путем объединения известных регуляторных элементов или использования искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов, представляющих собой усредненные канонические регуляторные последовательности, учитывающие особенности большого числа природных регуляторных элементов. Однако этими важными факторами не исчерпывается возможность оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении. [c.114]

Для реализации замысла по созданию новой белковой молекулы имеется несколько экспериментальных путей, в том числе и химический синтез полипептидных цепей. Однако наиболее популярным подходом к получению совершенно новых, а также измененных природных белков, является их биосинтез in vivo или in vitro. В этом случае создают ген исследуемого белка, клонируют его в экспрессирующем векторе и далее осуществляют транскрипцию гена с последующей трансляцией образовавшихся мРНК. Замены аминокислотных остатков в исследуемом белке проводят целенаправленно, создавая мутации в определенных участках рекомбинантного гена, т.е. осуществляя процесс направленного мутагенеза. [c.286]

В фагмидных экспрессирующих векторах на месте стыковки гена белка оболочки и клонируемого гена часто помещают кодон терминации трансляции. При таком устройстве вектора система дисплея начинает функционировать только в супрессорных штаммах Е. соИ, а в отсутствие супрессии в бактериальных клетках синтезируется исследуемый белок клонотеки. Этот подход исключает необходимость переклонирования изучаемой последовательности нуклеотидов после отбора белка с нужными функциями с помощью фагового дисплея. Однако ограниченная эффективность супрессии может сделать уровень экспрессии гибридного белка на поверхности фаговых частиц очень низкой. [c.336]

Для экспрессии уже клонированного гена выбор хозяина имеет такое же важное значение, как и при самом клонировании. Наиболее подходящими хозяевами для получения белка часто оказываются клетки Е. соИ, поскольку с ними просто манипулировать и их легко выращивать в больщих объемах. Носле открытияинтронов,прерывающих кодирующие участки МНОГИХ эукариотических генов, для использования в экспрессирующих векторах чаще стали применять клонированные ьДНК, а не сами гены. Однако при синтезе активных форм определенных эукариотических белков в клетках Е.соИ возникает ряд проблем. Так, первичные продукты трансляции некоторых эукариотических генов должны подвергнуться специфическим посттрансляциои-ным модификациям, прежде чем образуются функ- [c.354]

Наряду с промоторами векторы, экспрессирующие рекомбинантные гены в клетках Е. соН, должны содержать и гомологичные терминаторы транскрипции. Необходимость в этом вызвана тем, что даже нетранслируемые избыточные 3 -концевые последовательности нуклеотидов мРНК, транскрибированной с рекомбинантного гена, отрицательно сказываются на эффективности ее трансляции, что, по-видимому, связано с участием таких последовательностей в образовании сложной третичной структуры рекомбинантных мРНК. [c.111]

Смотреть страницы где упоминается термин Трансляция экспрессирующие векторы: [c.121] [c.504] [c.511] [c.43] [c.43] [c.112] [c.113] [c.113] [c.171] [c.161] [c.161] [c.266] [c.355] [c.356] [c.120] [c.126] [c.245] [c.109] [c.135] [c.233] [c.359] [c.161] [c.300] [c.304] [c.212]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология