Бактерии экспрессия эукариотических генов

Один из основных путей адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды — регуля щя экспрессии генов. Этот процесс, детально изученный для бактерий и вирусов, заключается в специфическом взаимодействии определенных белков с различными участками ДНК, расположенными рядом с сайтами инициации транскрипции. Такие взаимодействия могут характеризоваться как позитивным (положительным), так и негативным (отрицательным) влиянием на уровень транскрипции. В эукариотических клетках используются и другие механизмы регуляции транскрипции. В контроле экспрессии генов могут участвовать амплификация, генные перестройки, переключение классов и посттранскрипционные модификации. [c.109]

Какие условия необходимы для эффективной экспрессии эукариотических генов в бактериях Поскольку нуклеотидные последовательности эукариотических и прокариотических промоторов различаются, для того чтобы [c.244]

Исследования генетики бактерий внесли очень большой вклад в наши знания о наследственности. Во-первых, они продемонстрировали сколь разнообразны генетические процессы, которые могут реализовываться в природе у отдельных видов организмов. Познание этого разнообразия у прокариот проливает свет на возможные механизмы взаимодействия генома человека с геномами вирусов и приводит к переоценке роли многих генетических явлений, наблюдавшихся у эукариотических организмов, но не находивших объяснения. Велика роль генетики бактерий и в изучении регуляции и экспрессии активности генов. Эта тема будет рассматриваться в последующих главах. Механизмы организации этих процессов у сравнительно простых прокариотических организмов закладывают основы для их понимания у более сложно устроенных эукариот. [c.227]

Только на первый взгляд экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных и дрожжевых клетках под контролем хорошо изученных регуляторных элементов представляется простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит неэффективно из-за образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для преодоления этих и некоторых других затруднений в последнее время широко используются культивируемые клетки животных и растений. [c.174]

Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК или синтетическая ДНК, содержащая кодирующую последоаательность, присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии — промотору и рибосом-связывающему участку. [c.437]

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия. [c.133]

Экспрессия эукариотических генов в прокариотических клетках не реализуется или реализуется с большим трудом В ядерных генах эукариот имеются интроны, а у бактерий нет системы сплайсинга, поэтому образующиеся чужеродные конечные продукты в бактериальных клетках, как правило, неактивны Однако использование векторных систем (в том числе "челночных") и ПЦР позволило успешно решать проблемы, связанные с созданием рДНК их клонированием и экспрессией в различных реципиентных клетках (прокариотических и эукариотических) [c.208]

Адаптация организмов к различным воздействиям окружающей среды осуществляется, в частности, путем изменения экспрессии (активности) генов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. Эукариотические клетки используют этот же принцип, хотя в регуляции экспрессии генов реализуются и некоторые другие механизмы. [c.81]

Многие белки при связывании с ДНК изгибают ее, а если подобных ДНК-белковых связей много, то нить ДНК может сформировать плотную спираль вокруг белкового комплекса с образованием нуклеопротеиновой частицы Известно, что у бактерий такие нуклеопротеиновые частицы образуются при связывании инициаторных белков с точкой начала репликации (см. разд. 5.3.9), а также при связывании ДНК с интегразой фага лямбда для катализа сайт-специфической рекомбинации (рис. 9-19). По-видимому, в таком сложном трехмерном соединении участвуют как конкурентное, так и кооперативное взаимодействия Аналогичные гипы взаимодействий используются при регуляции каталитической активности нуклеопротеиновых частиц, как показано на примере белкового комплекса, содержащего интегразу фага лямбда (рис. 9-20). В связи с тем, что при экспрессии эукариотических генов происходит связывание кластеров белков, регулирующих активность генов, [c.109]

Прокариотические системы экспрессии успещно используются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические пост-трансляционные модификации - гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому бьшо решено попытаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариотических экспрессирующих векторов. [c.154]

Экспрессия эукариотических генов в со//-системах хозяин-вектор. Сегмент эукариотической ДНК встроен вблизи промотора oli, чтобы обеспечить его транскрипцию в клетках бактерий. Эукариотические гены (такие, как показанный здесь ген X) обычно являются прерывистыми из-за наличия в них некодирующих сегментов (на рисунке они выделены точками), поэтому РНК-транскрипт гена X, образующийся в клетках oh, не способен транслироваться в правильный полипептид [c.301]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных или растений. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечи-ваюпдих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных или растений было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках высших эукариот, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток. [c.133]

Однако не всегда при успешной экспрессии чужеродного гена можно получить функционально активный продукт. Дело в том, что многие эукариотические белки активируются только после их модификации (например, после протеолиза, гликозилирования, фосфорилирования и т. п.), происходящей в результате действия специфических клеточных ферментов. Но чужеродные белки могут неправильно модифицироваться или не модифицироваться вообще. Это ограничивает выбор реципиентных клеток, когда нужно получить активные модифицированные белки. В таких случаях для клонирования генов приходится использовать клетки орга низмов, родственных тем, откуда были взяты гены. С этой целью разрабатываются системы клонирования и экспрессии генов в различных семействах бактерий и низших грибов, в растительных и животных клетках ( Транскрипция и трансляция. Методы , 1987 Maximizing gene expression , 1986). [c.314]

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу. [c.224]

Поскольку дрожжи представляют собой эукариотический организм, можно было бы ожидать, что гены различных эукариот, в том числе и те, которые содержат интроны, будут корректно экспрессироваться в дрожжевых клетках. Однако это не так. Например, экспрессия генов -глобнна кролика в дрожжах не происходит благодаря некорректности транскрипции и последующего сплайсинга РНК. Тем не менее, применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Такие клетки, подобно В. subtilis, секретируют значительное количество белков во внеклеточную среду, что используют также для секреции чужеродных белков. С этой целью к экспрессируемому гену присоединяется участок, кодирующий сигнальный пептид, обусловливающий секрецию и отщепляемый в ее процессе. В результате в клетке синтезируется белок, содержащий на N-конце сигнальный пептнд. Этот белок секретируется в окружающую среду. Таким образом были получены, например, штаммы дрожжей, секретирующие интерферон человека. [c.440]

Дель многих опытов по клонированию состоит в наработке в большом количестве какого-либо белка эукариот. Именно для этого и встраивают гены эукариот в плазмиды бактерий, Чтобы достичь высокого уровня экспрессии гена, эукариотическую ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора транск- [c.318]

Рассмотренный подход эффективен в отношении как эукариотических клеток, так и бактерий. В случае эукариот обращенный ген соответствует нормальному гену, ориентированному противоположным образом. При некоторых способах регуляции экспрессии генов у бактерий РНК осуществляет регуляторную функцию благодаря своей комплементарности с последовательностью РНК-мишени. Регуляция может происходить на этапе репликации ДНК (гл. 33) или транскрипции (гл. 36). Направленную регуляцию можно осуществлять с помощью малой РНК, комплементарной 5 -концу мРНК-мишени. [c.341]

Мембраны, окружающие ядра эукариотических клеток, защищают связанный с ДНК тонкий механизм контроля от многих происходящих в цитоплазме химических изменений. Кроме того, они позволяют пространственно разобщить две ключевые стадии экспрессии генов 1) синтез РНК по матрице ДНК (транскрипцию ДНК) и 2) использование этих последовательностей РНК для синтеза определенных белков (трансляцию РНК). В прокариотических клетках нет такой компартментации и трансляция РНК с образованием белка происходит по мере образования РНК при транскрипции, начинаясь раньще, чем завершился синтез РНК. У эукариот, напротив (за исключением митохондрий и хлоропластов, которые в этом отнощении, как и в других, ближе к бактериям), указанные этапы пути от гена к белку строго разобщены транскрипция происходит в ядре, трансляция - в цитоплазме. РНК, прежде чем включиться в процессы синтеза белка, должна покинуть ядро. Для этого, находясь в ядре, РНК претерпевает сложный процесс созревания (процессинг), в ходе которого одни части молекулы РНК удаляются, а другие модифицируются. [c.41]

Конъюгативный перенос бактериальных генов в клетки животных. Перенос генов во время конъюгации бактериальных клеток, когда мужские и женские клетки вступают в контакт друг с другом через объединяющий их цитоплазматический мостик, является широко распространенным и хорошо изученным генетическим явлением [224, 225]. Недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных [226]. В этой серии экспериментов В.Л. Ватерсу удалось показать, что гены устойчивости к антибиотикам, находящиеся в составе конъюгатив-ной плазмиды Е. соН, переносятся с низкой частотой в клетки яичников китайских хомячков СНО К1 из бактериальных клеток, давая возможность клеткам-реципиентам выживать на селективной среде в присутствии соответствующих антибиотиков. При этом не происходило поглощения бактериальных клеток клетками животных посредством эндоцитоза, и перенос имел место в присутствии ДНКазы в питательной среде, что исключало непосредственный захват ДНК клетками из культуральной жидкости. Чужеродная ДНК реплицировалась в клетках животных, а экспрессия генов генетических маркеров происходила лишь в том случае, если гены находились под контролем эукариотических промоторов. Хотя конъюгативный перенос генов бактерий в клетки дрожжей, а также растений (Ti-плазмиды) известен давно, обсуждаемая работа впервые продемонстрировала возможность непосредственного обмена генами между бактериями и клетками высших животных. В том случае, если данный процесс удастся оптимизировать, у генной инженерии появится дополнительная возможность введения очень больших молекул ДНК в клетки животных, в том числе и в целях генотерапии. [c.154]

Для медрщинских целей растения используют тысячи лет, но генетическая ршженерия позволила создать новые растения, белковые продукты которых важны для терапии различных заболеваний. Гены терапевтически важных белков человека и животных можно вводить в разные системы экспрессии, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки. Идеальной является система экспрессии, которая наиболее безопасна и обеспечивает продукцию биологически активного продукта по минимальной цене. В системе клеток млекопитающих могзт синтезироваться белки человека и животных, в максимальной степени схожие с природными, но культивирование таких клеток дорого и ограничено по масштабу Бактерии можно производить в большом масштабе, но синтезируемые в них эукариотические белки далеко не всегда имеют правильную третичную структуру. Кроме того, они не могут подвергаться посттрансляционной модификации. [c.468]

Регуляторные белки, связывающиеся с определенными последовательностями ДНК в эукариотических клетках, должны взаимодействовать не просто с молекулой ДНК, как у бактерий, а с ДНК, которая на всем своем протяжении связана с нуклеосомами. Необходимость транскрибировать ДНК в составе хроматина несомненно усложняет контроль транскрипции, однако о том, как действуют соответствующие механизмы, известно очень мало. С уверенностью можно утверждать лишь то, что у эукариот изменения в упаковке ДНК влияют на экспрессию генов. Как отмечалось выше, сайленсер, регулирующий транскрипцию у дрожжей, каким-то образом закрьвает участки хроматина, расположенные с ним по соседству, и делает их недоступными дпя транскрипции и для воздействия эндонуклеазы (см. разд. 10.3.4). Однако задолго до открьпия этого явления изучение клеток высших эукариот продемонстрировало существование гораздо более сильно закрьпого хроматина, при этом в его структуре наблюдались видимые изменения. [c.207]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология