Бактерии, гибридизация колоний

Часто при первичном отборе клоны на чашках Петри вырастают настолько плотно, что после гибридизации с зондом бывает трудно выделить с первого раза бактерии, относящиеся к одному клону или фаговые частицы одной бляшки, которые дали положительный сигнал во время проведения первого раунда отбора. В этом случае бактериальные клетки или фаговые частицы, выделенные из зоны сигнала, рассевают до отдельных колоний или бляшек и используют во втором раунде отбора. Как правило, с помощью такого простого подхода удается расчистить нужные клоны и выделить их в гомогенном состоянии. [c.167]

На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист специального нейлонового фильтра на него переходит часть клеток бактерий каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате получается реплика на чашке и на фильтре колонии распределены одинаково. ДНК прочно связывается (иммобилизуется) с нейлоновым фильтром. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК клонов нейлоновый фильтр обрабатывают щелочью. Затем фильтр помещают в раствор, содержащий меченый зонд (кДНК или мРНК, или синтетический олигонуклеотид). При гибридизации зонд связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные меченому зонду фильтр отмывают от несвязавшихся молекул зонда и проводят радиоав- [c.46]

Рис. 5-83. Эффективный метод, широко применяемый для выявления бактериальной колонии, содержащей определенный клон ДНК (см. также рис. 5-79). Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колонии из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидпую ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Колонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтографии.

Гибридизация с колониями позволяет анализировать дрожжевые штаммы на содержание специфических нуклеотидных последовательностей. Приготовление дрожжевых образцов несколько отличается от процедуры, описанной для Е. соИ однако после того, как нитроцеллюлозный фильтр-реплика с ДНК подготовлен, дальнейшие операции аналогичны тем, которые используются для бактерий. Соответствующая методика приведена в табл. 7.7. Другой вариант этого метода описан Р. Ротстейном в гл. 3 первого тома [29] данной серии. [c.231]

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является вьщеление искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки). [c.43]

Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10 , 10 и 10" на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на /з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Miilipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний. [c.31]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Для примера рассмотрим схему гибридизации нуклеиновых кислот в колониях Es heri hia oli (рис. 1.20). Колонии бактерий, вырос- [c.34]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология