Гибридизация на фильтрах

После гибридизации фильтры накладывают на рентгеновскую пленку, на которой после проявления обнаруживаются полосы, соответ- [c.309]

Проведите предварительную гибридизацию фильтра в растворе, содержащем [c.28]

Проведите предварительную гибридизацию фильтров в точности так, как это описано в табл. 1.4. [c.29]

Таблица 2.5. Гибридизация фильтров

После гибридизации фильтра П в течение по крайней мере 6 ч выньте фильтр, промойте его, промокните насухо и оберните пластиковой пленкой. Экспонируйте с ним рентгеновскую пленку. При необходимости можно использовать кассету, которой не пользовались для полосок, отпечатанных с геля. Экспонируйте около 6 ч. [c.48]

Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее (разд. IV, А). Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга (разд. IV, Б), который прогревают 10— 15 мин при 70 °С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию (разд. IV, В—Д). Положительный клон высевают штрихом в свежую чашку с агаром L-амп и подготавливают ночную культуру для выделения ДНК в среде L-амп. [c.31]

Реакцию гибридизации обычно проводят в полиэтиленовом пакете, поместив фильтр между двумя листами толстого полиэтилена, края которых сваривают с трех сторон. Четвертую сторону сваривают после добавления нескольких миллилитров буферного раствора для предварительной пропитки фильтра. Далее фильтр инкубируют при температуре гибридизации в течение короткого периода, что необходимо для сведения фоновой гибридизации к минимуму. После предварительной пропитки буфер выжимают из пакета, добавляют в него 1 -2 мл буферного раствора для гибридизации и одноцепочечный зонд с меткой Р и пакет снова герметизируют. По завершении реакции гибридизации фильтр извлекают из пакета и промывают в жестких условиях (0,1 х 88С, [c.69]

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцел-люлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентичные первым. [c.121]

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Процедура ДНК-гибридизации состоит в следующем. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо пришивают к твердой подложке (нитроцеллюлоз-ному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.11). Гибридные молекулы можно [c.65]

Нерадиоактивные методы детекции В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. [c.190]

Наиболее простым способом гибридизации является проведение ее с образцом, нанесенным в виде пятна на некоторую подложку (дот-гибридизация, от англ. dot — пятно). Этот тип гибридизации фактически уже описывался на примере анализа на содержание гена энтеротоксина, Разрешающая сила метода повышается, если анализируемый образец предварительно подвергнуть гель-электрофорезу. В этом случае полезно перенести материал с геля на более удобный для проведения гибридизации материал, приведя гель в контакт с целлюлозным или нейлоновым фильтром. Добавление меченых зондов позволяет обнаружить полосы, несущие определяемые последовательности. Этот метод известен как гибридизация по ay зерну. [c.263]

Идентификация клонов. Если вставка содержит гены, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку, для чего используют методы гибридизации. Бактериальные (нлн фаговые) колонии выращиваются на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой (рис. 253). После этого приготавливаются так называемые реплики — к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым. [c.436]

Если гибридизация проводится не в растворе, а на фильтрах, этот метод называют блот-гибридизацией. [c.96]

Метод гибридизации ДНК-ДНК с использованием нитроцеллюлозных фильтров [c.109]

Наряду с описанным выше методом гибридизации применяют также так называемую конкурентную гибридизацию. В этом случае отжиг иммобилизированной ДНК на фильтре с реперной ДНК проводят в присутствии избытка фрагментированной и денатурированной гетерологичной ДНК. [c.113]

Гибридизация РНК с иммобилизированной на фильтре [c.115]

Удобным средством для обнаружения гибридизации являются нитроцеллюлозные фильтры [177], пропускающие свободную РНК (стр. 64), но задерживающие гибриды РНК с денатурированной ДНК. [c.234]

Фильтр, содержащий ДНК, помещают в раствор РНК. Носле гибридизации фильтр извлекают, гибрид очищают, а в раствор РНК помещают свежий фильтр, содержащий такое же количество ДНК, и проводят гибридизацию точно в тех же условиях, что и в первом случае. Повторяют гибридизацию с новыми фильтрами. На фиг. 8 представлены результаты идеализированного опыта с истощением для препарата иРНК. РНК, комплементарная большей части ДНК (иРНК), избирательно удаляется из раствора на первых фильтрах. На последних фильтрах остается РНК, комплементарная небольшой части ДНК (рРНК). Заштрихованная площадь соответствует количеству иРНК в препарате. В опытах с истощением не следует применять РНК-азу. В приведенном выше примере количество [c.164]

Гибридизацию между ДНК и фрагментами рРНК проводили на мембранных фильтрах при 44, 55 или 67°. После гибридизации фильтры помещали в свежий раствор буфера 2 X SS и инкубировали их при той же температуре в отсутствие РНК и в отсутствие РНК-азы (светлые значки) и в присутствии РНК-азы (темные значки). Изучали кинетику разрушении гибридов. [c.166]

Поеле гибридизации фильтры высушивают на воздухе (если планируется повторно гибридизовать фильтры с другой пробой, не высушивайте их полностью — см. инструкцию Ра11/В1о(1упе) [c.53]

После гибридизации фильтры промывают одинаково независимо от того, РНК или ДНК использовались в качестве зонда. Первые три раза — 1 л 2XSS , 0,1% ДСН при комнатной температуре по 20 мин. Конечная промывка — 30 мин при 65 °С в 0,1 SS , 0,1% ДСН. Условия последней, более жесткой промывки, могут быть изменены. Эта промывка нужна только при использовании высокогомологичных проб. [c.55]

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является вьщеление искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки). [c.43]

Одна из главных задач — поиск нужного клона. Если есть меченая проба , например кДНК, синтезированная на мРНК, то нужный клон находят с помощью гибридизации с колониями. Делают отпечаток с чашки, на которой растут колонии, на нитроцеллюлозном фильтре. Затем проводят гибридизацию фильтра с меченой ДНК и выявляют колонии, связывающие меченую пробу. Эти колонии далее пересевают и получают клон, содержащий нужный ген. Есть и много других методов вылавливания нужных клонов из их множества, получаемого на первом этапе эксперимента. [c.31]

Перед гибридизацией с меченой пробой фильтр предварительно инкубируют в растворе, содержащем разнообразпше сложные макромолекулы с длинной цепью, главным образом белки (сухое молоко), а также фрагментированную ДНК из спермы лосося или сельди. Эти молекулы прикрепляются ко всем участкам фильтра, не связанным с ДНК, и, таким образом, препятствуют неспецифическому связыванию при гибридизации меченой ДНК. После гибридизации фильтр тщательно промывают, чтобы удалить всю неспецифически связанную метку, и зоны гибридизации выявляют радиоавтографией. [c.293]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Рис. 4.11. ДНК-гибридизация. Исследуемую ДНК подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п. н.) тоже денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и проводят их отжиг. Для удаления негибри-дизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается. (Метка на рисунке обозначена цветной звездочкой.)

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Нозерн-блоттинг (Nothem blotting) Перенос молекул РНК, подвергнутых элктроферезу, с геля на твердую подложку (нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр) с последующей ДНК—РНК-гибридизацией. [c.554]

Саузерн-блотгипг (Southern blotting) Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса денатурированных молекул ДНК, подвергнутых электрофорезу, с агарозного геля на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр за счет капиллярного эффекта и гибридизации с меченым зондом, комплементарным искомой последовательности. [c.559]

Этот метод заключается в том, что после лизиса клеток хозяина ДНК различных клонов, фиксированную например, на нитроцеллюлозном фильтре, после удаления сопутствующих белков подвергают термообработке, в ходе которой происходит отжиг — раскручивание двунитевых молекул и образование клубков однонитевых ДНК. То же самое продельшают с меченой ДНК-зондом. Если теперь обработать препаратом однонитевой ДНК-зонда раскрученные ДНК клонов при медленном охлаждении, то может произойти образование гибридных двунитевых молекул — гибридазация — и включение метки в фиксированный препарат ДНК. Для образования гибридных молекул достаточно комплементарности последовательностей обеих ДНК из 15-20 нуклеотидов. Вероятность случайного совпадения такого числа комплементарных оснований (или еще более длинных фрагментов ДНК) в неродственных молекулах ДНК ничтожна. Поэтому гибридизация является чрезвычайно селективным и надежным тестом на присутствие родственной молекулы ДНК. [c.106]

В специализированных лабораториях вирулентность культур определяют на экспериментальных животных и методами генодиагностики. Для выявления энтеротоксина (холерогена) кроликов-сосунков весом около 150 г после лапаротомии заражают внутри-кишечно дозами 10 и 10 микробных клеток (по двое животных). Через 48 ч исследуют погибших (или забитых) животных, отмечая патологоанатомические признаки интоксикации расширение кишки, инъекции сосудов, кровоизлияния и т.п. В ходе генодиагностики у культур выявляют нуклеотидные последовательности гена токсина (vet). Для этого применяют соответствующие ДНК-зонды (ДНК-ДНК гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах) или ПЦР со специфическими праймерами. [c.169]

Гибридизацию исследуемой ДНК-ДНК, иммобилизированной на фильтре, проводят в 1,5—2 мл раствора 2XSS b бюксах диаметром 2,5 см и высотой 4 см, снабженных пришлифованными крышками. В бюкс с 1,5—2,0 мл 2XSS опускают нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизированной в нем ДНК, добавляют денатурированную реперную ДНК (в количестве до 100 y)- Смесь инкубируют при 60—65° в течение 16—18 часов. Затем инкубационную смесь медленно охлаждают. [c.112]

Зерна ДНК-геля переносят в термостатированную колонку со стеклянным пористым фильтром у дна и промывают несколькими порциями 4 X SS при 60°. Промытые зерна ДНК-агаро-вого геля хранят при 4° в 4XSS . Концентрацию ДНК в геле находят спектрофотометрическим методом после растворения навески геля путем кипячения в 5 М Na 104. Стандартные препараты ДНК-агарового геля содержат обычно 400 у ДНК на 1г сырого агара. I Для гибридизации берут 0,5—1 г ДНК-агара (сырой вес) и смешивают с 1 мл (20—50 у на 1 мл) денатурированной и фрагментированной непосредственно перед гибридизацией раствор фрагментированной ДНК денатурируют нагреванием, быстро охлаждают и доводят концентрацию растворителя с помощью 10 X SS до 4 X SS . [c.114]

ДНК иммобилизуют в фильтр, как описано на стр. 11L Гибриды РНК-ДНК получают инкубацией 10—100 y меченой РНК с ДНК-фильтром в 0,5—2 мл 2Х SS или 6 X SS . Перед гибридизацией все образцы РНК прогревают в течение 10 минут при 90° в 0,01 X SS и быстро охлаждают. Затем фильтры обрабатывают РНК-азой (20 у на 1 мл,ъ 5 мл 2XSS при 37° в течение часа). После обработки РНК-азой фильтры промывают, высушивают и просчитывают их радиоактивность. [c.115]

Гибридизация РНК с ДНК в растворе по Гилешпи и Шпигельману. Образование гибридов происходит в жидкой фазе. После инкубации пробирки охлаждают и их содержимое собирают на мембранные фильтры. Последние промывают, обрабатывают РНК-азой, снова промывают, высушивают и Просчитывают их радиоактивность. [c.115]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология