Рекомбинантные бактерии

Образование корневых клубеньков симбиотическими бактериями. Целью этих исследований было создание рекомбинантных бактерий, способных конкурировать с природными симбиотическими бактериями. [c.306]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

А получение рекомбинантных бактерий и рекомбинантных вирусов. Синтез отдельных генов вирусов и бактерий. Получение рекомбинантных штаммов бактерий и вирусов, сочетающих свойства родительских особей или приобретающих новые свойства [c.17]

Видимо, правильно будет определить биотехнологию как сферу деятельности, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным образом клеток микроорганизмов, животных и растительных клеток, использует эти процессы и сами объекты для промышленного производства продуктов, необходимых в жизни человека, а также получения биоэффектов, ранее не встречавшихся в природе (например, получение рекомбинантных бактерий, трансгенных растений и животных). [c.93]

Если к культуре Е. соИ добавить рекомбинантные плазмиды, то они при определенных условиях включаются в бактериальные клетки — получаются рекомбинантные бактерии (рис. 5.14). Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК для этого рекомбинантные плазмиды обрабатывают той же рестриктазой, с помощью которой они были созданы (см. рис. 5.13). Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей. Отметим, что этот результат вполне подобен результату, получаемому при использовании ПЦР и в том и в другом случае происходит накопление исследуемой ДНК по этой причине ПЦР часто называют молекулярным клонированием ДНК. [c.173]

Частичный перенос хромосомы из мужской клетки приводит к тому, что Р -клетка становится частично диплоидной (мерозигота), т. е. содержащей двойной набор многих генов. В такой частично диплоидной клетке между двумя хромосомами происходит обмен генетической информацией (генетическая рекомбинация) (рис. 15-2). Химические реакции, лежащие в основе этого процесса, имеющего важное значение для всех организмов, размножающихся половым путем, мы рассмотрим в разд. Ж- В конечном счете рекомбинационный процесс приводит к тому, что дочерние клетки, образовавшиеся при последующем делении, содержат только одну хромосому с обычным числом генов. Однако некоторые гены попадают в эту хромосому от каждого из родительских штаммов. Таким образом, может случиться, что клетка Р мутантного штамма, неспособная расти на среде без определенных питательных добавок, получит ген из мужской клетки, который позволит ей расти на минимальной среде. Хотя число таких рекомбинантных бактерий мало, тем не менее их легко можно отобрать из очень большого числа исходна смешанных мутантных бактерий. [c.191]

Растения дают большое количество биомассы, а выращивание их не составляет труда, поэтому разумно было попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать коммерчески ценные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий, которых культивируют в больших биореакторах (при этом необходимы высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не нужно больших средств и квалифицированных рабочих. Основная проблема, которая может возникнуть при использовании растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной стоимостью производства нужного белка с помощью трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и полимера поли-Р-гидроксибутира-та, из которого можно изготавливать материал, подверженный биодеградации. [c.412]

Ключевым в признании генетически модифицированных микроорганизмов охраноспособными стало судебное решение, касающееся рекомбинантных бактерий, созданных А. Чакрабарти. В 1980 г. Верховный суд США постановил, что на бактерии, полученные в результате генетических манипуляций, может быть выдан патент. Позднее патенты США были выданы на трансгенную мышь с повышенной частотой возникновения злокачественных опухолей и некоторые трансгенные растения. Однако патентование животных, полученных с помощью методов генной инженерии, разрешено не во всех странах. [c.541]

Рис. 12.4. Превращение D-глюкозы в 2-KLG рекомбинантной бактерией Erwinia herbi ola. Все участвующие в этом процессе ферменты обозначены буквой Е и последовательно пронумерованы, указана также их клеточная локализация.

Одним из важных условий эффективности биоконтроля патогенных микроорганизмов с помошью бактерий, стимулирующих рост растений, является способность этих бактерий к распространению в естественных условиях. В Канаде, скандинавских странах и на севере США они должны сохранять жизнеспособность в условиях долгих холодных зим, а весной размножаться при относительно низких температурах почвы (-5-10 °С). Поскольку микроорганизмы используют разные адаптивные стратегии выживания в неблагоприятных условиях, можно попытаться сконструировать с помощью генной инженерии рекомбинантные бактерии, оптимально приспособленные к низким температурам. Недавно было показано, что некоторые почвенные бактерии (а среди них встречаются и такие, которые стимулируют рост растений) могут размножаться при 5 °С и секретировать в окружающую среду антифризные белки при низких температурах. Такие белки регулируют образование кристаллов льда внутри бактериальной клетки. Хотя в их присутствии кристаллы все же формируются, они не достигают больших размеров и не разрушают клетки. Как только будут идентифицированы гены бактериальных антифризных белков, их можно будет перенести в клетки бактерий, стимулирующих рост растений, с тем чтобы получить трансформированные бактерии, устойчивые к низким температурам. Пока нет никаких данных о наличии связи между антифризной активностью бактерий и механизмом, обеспечивающим их вьгживание при низких температурах. Очень ин- [c.325]

Инсектициды, продуцируемые В. thuringiensis, при их нанесении на листья и стебли не действуют на насекомых, повреждающих корни растений. Чтобы обойти эту трудность, можно ввести ген токсина В. thuringiensis в штамм одного из видов бактерий, которые обитают в слое почвы, непосредственно прилегающем к корням (в ризосфере). Такие рекомбинантные бактерии, внесенные в почву, будут секретировать инсектицидный токсин прямо в ризосферу и защищать корни от насекомых все то время, в течение которого они остаются в почве. Это устраняет необходимость многократной обработки растений биологическими или химическими инсектицидами. [c.340]

Обнаружение лизогенных и нелизогенных штаммов у способного к конъюгации штамма Е. oli К12 дало возможность проводить скрещивания таких бактерий и изучать распределение профага А, у рекомбинантов. Первые скрещивания такого рода были осуществлены в то время, когда природа процесса конъюгации бактерий оставалась еще неясной, а частота появления бактериальных рекомбинантов в условиях опыта составляла примерно 10 на клетку. Тем не менее уже эти скрещивания показали, что профаг, по крайней мере в одном отношении, ведет себя как хромосомный детерминант наследственности, а именно некоторые рекомбинантные бактерии оказались лизогенными, а другие — нелизогенными. Характер распределения профага среди рекомбинантных бактерий указывает, что лизогенность по фагу сцеплена с генами gal, контролирующими сбраживание галактозы. Большинство рекомбинантов получает признаки gal и лизогенность по фагу (X) от одного и того же родителя. Однако в отличие от обычных хромосомных генов профаг X дает асимметричное распределение в реципрокных скрещиваниях между лизогенными и нелизогенными бактериями. Если нелизогенный донор скрещивается с лизогенным реципиентом F , то признак нелизогенности передается от донора к рекомбинантам, но при скрещивании с нелизогенным реципиентом F" признак лизогенности от донора F" " (X) почти никогда не обнаруживается у рекомбинантов. [c.342]

Распределение профага к среди рекомбинантных бактерий носит, однако, совершенно аномальный характер, если лизогенным оказывается родитель Hfr, а нелизогенным — родитель F". В таком случае профаг почти никогда не наследуется рекомбинантами. Кроме того, частота появления рекомбинантов оказывается очень низкой, а те рекомбинанты, которые все же возникают при этом, по своим генетическим свойствам резко отличаются от рекомбинантов, возникающ,их при скрещиваниях Hfr X F"(X) или Hfr(X) X F (X). Жакоб и Вольман показали, что эта аномалия является следствием явления, названного ими зиготной индукцией. Всякий раз, когда в нелизогенную клетку F проникает фрагмент хромосомы лизогенной бактерии-донора Hfr, несущей профаг Я, этот профаг индуцируется, переходит в вегетативное состояние и, размножаясь, дает от 1 до 200 частиц инфекционного фага X, которые в конечном итоге лизируют зиготу и высвобождаются. При таких скрещиваниях большая часть зигот, получивших от Hfr-бактерии фрагмент хромосомы с профагом, погибает. Следовательно, у рекомбинантов могут проявиться только те генетические маркеры донора, которые передаются раньше профага, т. е. располагаются ближе к началу хромосомы. Однако если при таком скрещивании лизогенной оказывается бактерия-реципиент F", то зиготной индукции не происходит, независимо от того, является ли донор Hfr лизогенным или нет. В потомстве, полученном от таких скрещиваний, не наблюдается аномалии в расщеплении родительских признаков. Таким образом, присутствие профага X обусловливает иммунитет реципиента F не только в отношении суперинфекции гомологичным свободным фагом X, но и в отношении вегетативного развития гомологичного внутри-хромосомного профага X, полученного клеткой-реципиентом от бактерии-донора Hfr. [c.343]

Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, и их размеры постепенно уменьшаются по мере увеличения числа раундов репликации таких рекомбинантных плазмид in vivo. Выраженное делетирование чужеродной ДНК в плазмидах большого размера связано с тем, что в бактериальных клетках селективное преимущество получают те плазмиды, время репликации которых минимально. Поэтому нуклеотидные последовательности ДНК, не участвующие в репликации векторных плазмид, постепенно элиминируются посредством делеций при длительном культивировании рекомбинантных бактерий. [c.80]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Метод генетической инженерии используют в том случае, когда исходное сырье для получения препарата традиционным способом является дефицитным или дорогостоящим. Например, лейкоцитарный а-интерферон получают из лейкоцитов донорской крови человека. Из 1 л крови получают 2—3 дозы высококонцентрированного интерферона. На курс лечения онкологического больного требуются сотни доз препарата. Следовательно, массовое производство и применение лейкоцитарного интерферона из крови нереально. Производство лейкоцитарного интерферона методом генетической инженерии значительно экономичнее и не требует дефицитного сырья (крови). Его получают путем выращивания рекомбинантных штаммов бактерий (Е. oli, псевдомонад), способных продуцировать интерферон в результате встройки им гена а-интерферона. Из 1 л культуры рекомбинантных бактерий получают 100—150 доз лейкоцитарного интерферона с активностью 10 МЕ. [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология