Фрагменты случайные

Можно полагать, что в жидком аргоне соседние атомы располагаются в среднем примерно так, как в случайной плотной упаковке стальных шаров. Но мы ничего не можем сказать о фрагментах этой упаковки. Являются ли они ассоциатами атомов аргона или случайными скоплениями несвязанных частиц, — этот вопрос остается без ответа. Радиальная функция распределения отражает среднюю корреляцию между атомами, но природа этой корреляции обычно выясняется другими методами. Так, анализ свойств паров аргона говорит о присутствии в парах ассоциатов. Изучение свойств кристаллов аргона приводит к выводу о важной роли многочастичных взаимодействий, сопровождающихся обобществлением электронов. [c.124]

Нетрудно заметить, что формулы (1У.7б) и (1У.39) имеют одинаковый вид, только вместо (1У.39) в (1У.76) стоит функция Такое сходство может показаться странным, поскольку (1У.39) выведена суммированием вкладов только древесных диаграмм, а формула (1У.76) описывает гель, содержащий циклические фрагменты. Однако оно не случайно и может быть объяснено с помощью методов теории поля для систем, содержащих конденсат [180], роль которого в рассматриваемом случае играет гель. Для вычисления корреляционных функций в рамках приближения СП в таких системах рассмотрение циклической диаграммы сложной топологии, которая в термодинамическом пределе отвечает конденсату, можно заменить ее эквивалентным набором бесконечных хордовых деревьев. Последние получаются из графа путем разрезания всех его циклических ребер всевозможными способами. [c.278]

В руках у исследователя неизвестный полисахарид (не будем говорить о том, как он был выделен и очищен — это само по себе большая и сложная тема). Белый порошок, растворим в воде, нерастворим в обычных органических растворителях. Вот, собственно, и все, что о нем пока известно. А что нужно узнать Структуру. Иными словами, расставить по местам те десятки тысяч атомов, из которых состоят молекулы связать их одним единственным способом ковалентными связями. В последней фразе задача сформулирована вполне точно, однако решить такую задачу в лоб современной науке не под силу. Нельзя последовательно установить положение одного атома за другим, если общее их число измеряется тысячами или десятками тысяч — это потребовало бы невообразимых затрат труда и времени. Поэтому общая стратегия структурного анализа таких сложных объектов состоит в разборке молекулы на более мелкие блоки, установлении структуры этих блоков (если и они сложны, то также путем предварительного расщепления на еще более мелкие фрагменты) и затем в реконструкции (мысленной) исходной системы. К счастью (и это далеко не случайное везение, а глубоко обоснованный биологический принцип), все биополимеры построены именно по блочному типу и по самой своей природе сравнительно легко допускают такую разборку. Это значит, что в их молекулах чередуются сравнительно легко расщепляемые связи и участки из значительно более прочных связей. Такие участки и есть те самые блоки, [c.48]

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Бифуркационные флуктуации, как правило, представляют собой более или менее сложные комбинации случайных отклонений отдельных атомных групп, целых остатков или фрагментов, которые возникают почти одновременно. Очевидно, такие наборы конформационных отклонений будут стабильными, если все входящие в них элементарные флуктуации окажутся согласованными между собой, т.е. будут отвечать таким взаим- [c.96]

При неминуемом появлении в статистическом клубке устойчивых необратимых флуктуаций одни участки примут стабильные формы, а другие, промежуточные, останутся подвижными, хотя и их конформационная свобода за счет межостаточных взаимодействий значительно ограничится. Переход клубка в первое промежуточное состояние - результат действия бифуркаций на локальных участках. Их образование - поворотный момент, который определяет направленность процесса сборки и характер его дальнейшего развития. Впоследствии, также за счет случайно возникших флуктуаций, в специфические взаимодействия вовлекаются удаленные по цепи аминокислотные остатки из разных участков, и белок переходит во второе промежуточное состояние. Структурирование, вызванное новым набором согласованных необратимых флуктуаций, осуществляется за счет сближенности комплементарных и избирательно взаимодействующих конформационно жестких и лабильных фрагментов. Последние при этом обретают определенную форму. Появление в течение разумно короткого времени на завершающем этапе сборки необратимых флуктуаций на значительно больших, но уже частично структурированных участках также неизбежно. Увеличение количества взаимодействующих между собой остатков сопровождается уменьшением конформационных степеней свободы. Так что и здесь возможно выявление за короткое время необратимых флуктуаций при беспорядочно-поисковом механизме. [c.98]

Итак, благодаря избирательности бифуркационных флуктуаций и их строгой согласованности структурная самоорганизация белковой молекулы приобретает детерминистические черты (случайность порождает необходимость). Из конформационно жестких и взаимодействующих с ними лабильных фрагментов возникают нуклеации, которые через ряд чисто случайных, но тем не менее неизбежных и строго последовательных событий входят в домены или в нативную трехмерную структуру белка. Весь процесс самосборки пространственной структуры не требует времени больше, чем затрачивается на рибосомный синтез белковой цепи. Уникальность бифуркаций, порядок их возникновения и устойчивый конструктивный характер обусловлены конкретной, отобранной в ходе эволюции аминокислотной последовательностью. В то же время рассматриваемая модель свертывания не исключает образование "неправильных" промежуточных состояний, содержащих структурные элементы, отсутствующие в конечной конформации. Более того, поскольку в основу модели положен беспорядочно-поисковый механизм, осуществляющий сборку белка методом "проб и ошибок", то возникновение непродуктивных состояний белковой цепи становится неизбежным. Однако они нестабильны, так как продуктивные состояния, появляющиеся в результате бифуркационных флуктуаций, всегда более предпочтительны по энергии. К обсуждению этого вопроса вернемся в главе 17 при количественном описании механизма ренатурации панкреатического трипсинового ингибитора. [c.98]

Совместить диаметрально противоположные статистические и детерминистические особенности процесса, выявить их взаимообусловленность и показать неизбежность спонтанного возникновения высокоупорядоченной структуры из флуктуирующего клубка оказалось возможным лишь с помощью нелинейной неравновесной термодинамики. В предложенной на этой основе теории сборки белка постулируется динамическая гетерогенность белковой цепи, которая заключается в альтернировании вдоль развернутой аминокислотной последовательности потенциально конформационно жестких и лабильных участков. Первые могут образовывать относительно стабильные пространственные формы за счет невалентных взаимодействий входящих в них остатков, а вторые - представительные наборы близких по энергии и, следовательно, равновероятных форм. При такой конформационной дифференциации белковой цепи начальный этап ее структурирования предстает в виде возникающих одновременно и идущих параллельно и практически независимо друг от друга процессов свертывания локальных участков. Если протяженность чередующихся конформационно жестких и лабильных фрагментов сравнительно невелика, то при чисто случайно-поисковом механизме становится гарантированным появление в течение короткого времени необратимых бифуркационных флуктуаций, являющихся причиной реализации потенции определенных участков белковой цепи к автономному структурированию. [c.103]

На следующем этапе сборки проявляется взаимообусловленность конформационных состояний двух или большего числа жестких фрагментов и разделяющих их лабильных участков цепи. Рост длины цепи взаимодействующих остатков, однако, не сказывается существенным образом на продолжительности случайного поиска бифуркационных флуктуаций. Одновременно с увеличением размера автономно свертывающегося пептидного участка, включающего жесткие и лабильные фрагменты, резко сокращается число конформационных степеней свободы за счет их фиксации у первых и уменьшения конформационных возможностей вторых. Новая необратимая флуктуация возникает здесь на фоне более суженного базиса беспорядочных тепловых движений. Момент появления такой флуктуации случаен, но не случайны как сам факт ее появления, так и соответствующее ей стабильное конформационное состояние, определяемое лишь аминокислотной последовательностью данного участка белковой цепи. Энергетическая предпочтительность образовавшейся пространственной структуры обусловлена согласованностью невалентных взаимодействий не только между соседними остатками, что определило возникновение первой бифуркации, но и между далеко расположенными в цепи остатками. [c.104]

Эти особенности природных полипептидов, как будет подтверждено совместным рассмотрением опытных данных Крейтона и результатов расчета конформационных возможностей БПТИ, оказываются достаточными для сокращения области поиска и направления случайно возникающих флуктуаций по кратчайшему пути. Сборка белка при соблюдении отмеченных условий начинается одновременно и практически независимо на конформационно жестких по средним взаимодействиям фрагментах, разделенных лабильными участками последовательности. Случайный и беспорядочный перебор всех возможных флуктуаций практически автономных жестких фрагментов обязательно приведет к возникновению у каждого из них бифуркационной комбинации необратимых конформационных изменений, отвечающих уникальному сочетанию флуктуаций входящих в фрагмент остатков. Время, необходимое для структурной самоорганизации пептидного участка из п остатков по беспорядочно-поисковому механизму I - 10" с. Следовательно, продолжительность сборки конформационно жесткого фрагмента с п < 12 не превышает 10 с, т.е. вполне реально. Альтернирующие вдоль белковой цепи конформационно лабильные участки приблизительно той же длины за это время также претерпевают серьезные изменения. Реализация у них средних взаимодействий приводит к ограничению конформационной свободы. Из огромного массива случайных состояний путем все того же беспорядочного перебора обратимых и необратимых флуктуаций за время г = Ю" с возникает ограниченный набор устойчивых и при отсутствии дальних взаимодействий изоэнергетических состояний. [c.475]

Деструкция макромолекул ксилана начинается при 120...140°С в случайных местах по ослабленным связям с образованием фрагментов макромолекул. В начальном периоде в присутствии воды происходит частичный гидролиз, а по мере повышения температуры усиливаются реакции термической деструкции. Активный распад ксилана начинается уже при 220°С и продолжается до температуры примерно 290°С. [c.359]

Реакции химической деструкции полимеров протекают, как правило, по закону случая. Например, гидролиз полиэфира начинается не с конца цепочки и не развивается по механизму последовательного отщепления мономерных единиц. Реакция начинается с некоторой случайной группировки внутри цепи, поэтому образующиеся продукты реакции имеют большую молекулярную массу. Только в результате многократного повторения актов гидролитического расщепления полимер может быть разложен на фрагменты, соответствующие одной мономерной единице. Так как обычно в условиях проведения гидролиза или ацидолиза даже низкомолекулярные осколки полимера нелетучи, то за реакцией разложения нельзя следить гравиметрически (в противоположность термическому разложению). Часто в таких случаях реакцию контролируют, применяя титрование для определения количества непрореагировавшего реагента. Весьма чувствительной пробой на деструкцию является измерение вязкости раствора полимера по мере протекания реакции (см. опыты 5-18 и 5-19). [c.93]

Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью. [c.159]

По гипотезе Филлипса, ион карбония стабилизируется в активном центре фермента путем электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка Asp 52 (см. рис. 20), расположенной на расстоянии 3 А от положительно заряженного атома углерода С([). Это существенно ио-выщает вероятность встречи последнего с ионом гидроксила, случайно оказавшимся в подходящем положении в результате диффузии из окружающей среды [20]. На этом реакция заканчивается, и гликоновый фрагмент субстрата диссоциирует из активного центра лизоцима. Агликоновый фрагмент субстрата к этому времени уже должен десорбироваться с участков Е и F (и последующей части лизоцима справа от активного центра в случае более протяженных субстратов), чтобы обеспечить прохождение реакции трансгликозилирования, которая часто наблюдается в катализе лизоцимом. [c.173]

Соотношения предыдущего раздела позволяют по известному содержанию f -ад вычислить вероятности подграфов меньшего размера. Однако чаще исследователей интересует обратная задача описать конфигурационную статистику полимера, исходя из экспериментально измеренной концентрации малых фрагментов молекул. Для ее решения нужен конструктивный алгоритм вычисления вероятностей к- ] произвольного размера. В принципе, для этой цели можно воспользоваться подходом, предложеппым в работах [29, 30]. Однако рекуррентное применение (см. разд. 1.4) процедуры построения случайных графов весьма громоздко. Гораздо эффективней пспользовать для этой цели методы ветвящихся процессов, множество реализаций которых можно рассматривать как случайный [c.200]

В табл. 5.9 приведен фрагмент результатов практических расчетов производственной программы одного из НПП. В зависимости от задаваемых уровней надежности увеличение выпуска товарной продукции составляет 1,5—2 % по сравнению с вариантами, рассчитанными плановыми органами. Увеличение вьшуска достигается за счет улучшения структуры плана, интенсификации режимов установок с учетом варьируемости технологических коэффициентов в случайных областях, а также рационального распределения ресурсов. Следует особо отметить, что в этом случае обеспечивается расширение области варьирования технологических коэффициентов, по сравнению с детерминированными задачами, с учетом требований надежности и значительно улучшается совместимость ограничений, повышается надежность рассчитанных плановых показателей. [c.176]

Собственно химическая история этих структур началась в середине 1980-х годов с весьма далекой (в прямом и переносном смысле слова) проблемы трактовки абсорбционных и эмиссионных спектров межзвездной материи, в которой заподозрили наличие углеродсодержащих частиц неизвестной природы. В попытке разрешить загадку бьши предприняты модельные эксперименты по лазерному испарению графита, поскольку такие условия предполагались более или менее подобными существующим в межзвездном пространстве. Первоначальные эксперименты [12а] показали, что при этом образуется широкий почти случайный набор углеродных кластеров состава Сд в пределах и = 1 — 190, причем в интервале 20 < и < 90 обнаруживались только кластеры с четным и, т. е. состава С2 (10 < /л < 45) (рис. 4.3, кривая С). Эти результаты были интерпретированы как свидетельство образования линейных кластеров (—С=С-) , родственньос ранее обнаруженной новой форме углерода, карбину. Через год, в 1985 г., эти эксперименты повторили, используя несколько модифицированную технику, улучшающую условия образования кластеров из первичных углеродных фрагментов. Результаты были ошеломляющими вместо более или менее случайного распределения кластеров, о чем сообщалось ранее [12а], здесь масс-спектр продуктов свидетельствовал о появлении кластера Сбо> интенсивность пика которого превосходила интенсивность пиков соседних кластеров примерно в 40 раз (рис. 4.3, кривая А) [12Ь]. [c.395]

На рис. 5 показан фрагмент анализируемого изображения (15% наблюдаемой площади) в разные моменты времени. Направление вытеснения — из правого верхнего угла фрагмента в левый нижний. Видно, что в достаточно большом числе пор рассматриваемой части микромодели произошло замещение воды нефтью, т.е. после прохождения закачиваемой воды в эти поры попала нефть, что означает наличие в них разрыва вытесняемой фазы — макродиспергирования. Отметим, что выделенные поры представляют собой несвязную хаотичную структуру, что подтверждает движение вытесняемой фазы как случайной системы дисперсных элементов. [c.21]

Согласно другим данным, некоторые из повторяющихся последовательностей распределены по всему геному случайно. Об этом свидетельствует, например, тот факт, что при ренатурации фрагментов ДНК Дрозофилы образуются кольца ДНК, которые можно увидеть с помощью электронного микроскопа [278]. Кольца во время ренатурации могут образовываться в результате фрагментации внутри повторяющихся последовательностей. В хромосомах Хепориз может содержаться около -25% таких повторяющихся последовательностей. Данные, полученные при электронной микроскопии, свидетельствуют о том, что случайная реассоциация фрагментов ДНК приводит к образованию двухцепочечных участков, содержащих повторяющиеся нуклеотидные последовательности, с одноцепочечными хвостами . Последние обычно не спариваются, поскольку содержат уникальные последовательности, пришедшие из разных генов. У Хепори повторяющиеся фрагменты ДНК включают приблизительно 300 нуклеотидов, а неповторяющиеся, или уникальные, фрагменты, расположенные между ними, — приблизительно 800 нуклеотидов [275]. [c.298]

Представленные в табл. 7.4.1 тритерпеноиды отличаются достаточно высокой степенью функционализации электрофильного характера непредельные лактонные циклы, непредельные сопряженные кетоны, эпоксидные группы, аллильные спиртовые фрагменты — все эти функции химически активны по отношению к нуклеофилам, содержаш,им сульфидные группы, функции первичного и вторичного амина, прокарбанионные центры, т.е. настоящие тритерпены могут взаимодействовать с боковыми функциями белковых молекул, нуклеиновыми основаниями ДНК и РНК, многими кофермен-тами. Поэтому не является случайностью обнаружение среди них биологически активных субстанций самого различного типа (антифедантная. [c.182]

Хотя каждое нормальное колебание, по определению, является колебат. движением всей молекулы, нек-рые из них, особенно у больших молекул, могут более всего затрагивать лишь к.-л. фрагмент молекулы. Амплитуды смещения ядер, не входящих в этот фрагмент, при таком нормальном колебании очень малы. На этом основана широко используемая в структурно-аналит. исследованиях концепция т. наз. групповых, или характеристических, частот определенные функц. группы или фрагменты, повторяющиеся в молекулах разл. соед., характеризуются примерно одними и теми же частотами в К. с., по к-рым м.б. установлено их присутствие в молекуле данного в-ва (правда, не всегда с одинаково высокой степенью достоверности). Напр., для карбонильной группы характерна очень интенсивная полоса в ИК спектре поглощения в области 1700( 50) см , относящаяся к валентному колебанию С=0. Отсутствие полос поглощения в данной области спектра доказывает, что в молекуле исследуемого в-ва группы С=0 нет. В то же время наличие к.-л. полос в указанной области еще не является однозначным доказательством присутствия в молекуле карбонильной группы, т. к. в этой области могут случайно оказаться частоты других колебаний молекулы. Поэтому структурный анализ и определение конформаций по колебат. частотам функц. [c.431]

Для рассматриваемой модели это условие на первый взгляд выглядит нереальным, так как число возможных комбинаций случайных и беспорядочных конформационных флуктуаций белковой цепи невероятно велико, и появление среди них бифуркационных флуктуаций как будто бы ничтожно мало. Перебор всех микроскопических состояний даже у самых низкомолекулярных белков занял бы не менее лет. Противоречие между характером описываемого процесса и наблюдаемой продолжительностью свертывания снимается, если предположить, что актуальные на первом этапе сборки белка бифуркационные флуктуации возникают независимо и одновременно на разных участках полипептидной цепи. Иными словами, начало пространственного структурирования белка представляется рядом параллельно идущих процессов формообразования как бы не связанных друг с другом олигопептидных фрагментов молекулы. Чтобы это действительно могло происходить при вполне определенном сочетании необратимых флуктуаций, следует допустить возможность образования конформационно достаточно жестких структур только за счет взаимодействий остатков в пределах сравнительно коротких участков белковой цепи. При количестве возможных сочетаний низкоэнергетических флуктуаций порядка 10" (п - число аминокислотных остатков) и продолжительности одной флуктуации с время вероятного появления локальной структуры при беспорядочно-поисковом механизме ориентировочно равно 10> -14 Следовательно, для фрагмента белковой цепи, например с и = 12, время сборки составит всего 10 с. Чтобы процессы структурирования разных участков аминокислотной последовательности могли идти параллельно и независимо друг от друга, требуется также предположить чередование в белковой цепи конформационно жестких и лабильных фрагментов. [c.97]

Дифференциация свертьшаюшейся цегш на конформационно жесткие и лабильные фрагменты является поворотным моментом, определяющим направленность и характер дальнейшего развития процесса. Впоследствии также за счет случайно возникших флуктуаций в специфические взаимодействия вовлекаются удаленные по цепи остатки из разных ее участков, и белок переходит во второе промежуточное состояние. Струк-турирование, вызванное новым набором согласованных необратимых флуктуаций, осуществляется за счет сближенности комплементарных и избирательно взаимодействующих конформационно жестких и лабильных фрагментов, т.е. за счет дальних взаимодействий. Быстрое появление соответствующих необратимых флуктуаций здесь также неизбежно, поскольку увеличение количества взаимодействующих между собой остатков сопровождается уменьшением конформационных степеней свободы [c.248]

Расчет показал, что конформационно лабильные по средним взаимо-действиям участки Pro - ys и ys -Ala" обретают свои окончательные пространственные формы только по завершении сборки -структуре, ys - ys , которая служит для их укладки матрицей, обеспечивающей образование многочисленных стабилизирующих контактов между удаленными по цепи остатками. Наличие у одного из ди-85-продуктов дисульфидной связи ys - ys отвечает самой ранней стадии формирования -структуры, когда фрагмент Arg - ys еще лишен дальних взаимодействий с последующими остатками и является практически свободным. Как показал расчет (см. табл. IV.5 и рис. IV.9), наиболее низкой энергией в этом случае обладает конформация фрагмента со сближенными боковыми цепями ys и ys , отличающаяся от нативного состояния только значением угла v остатка Рго . Возникающее в период зарождения -структуры случайное отклонение, сближающее 5-й и 14-й остатки ys, оказывается самой предпочтительной по энергии, или, иными словами, неравновесной бифуркационной флуктуацией. Это отклонение станет невозможным или потеряет свою актуальность, будет высокоэнергетичным и обратимым, если оно появится позднее, в середине или в конце процесса формообразования -структуры. Статус бифуркационной флуктуации приобретет другое конформационное отклонение, сближающее остатки ys и ys . Как следует из расчета [11], образование дисульфидной связи ys - ys в ситуации, близкой к стадии полного завершения -структуры, также реально и энергетически выгодно. Сближенность остатков ys и ys достигается в конформации фрагмента Arg - ys , отличающейся от его состояния в нативной структуре белка значением лишь одного двугранного угла ф остатка Gly . [c.478]

Перед тем как ответить на эти вопросы и приблизиться к пониманию ррйствительного механизма свертывания полипептидной цепи БПТИ, аапомним некоторые особенности рассматриваемого явления ренатурации ревете предложенной неравновесной термодинамической теории и физической теории структурной самоорганизации белков. Во-первых, все со-Рытия, совершающиеся в процессе свертывания полипептидной цепи белковой молекулы, являются беспорядочными возникновение как обратимых, так и необратимых флуктуаций имеет исключительно случайный арактер. Во-вторых, флуктуации тем более необратимы, чем ближе они Шодводят пространственное строение фрагментов белковой цепи к конфор-Кационным состояниям, реализующимся в нативной структуре молекулы В-третьих, появление актуальных для каждой стадии свертывания белка необратимых флуктуаций всегда неизбежно и своевременно. [c.479]

Сравнение кривых поглощения случайно ориентированных и полностью ориентированных макромолекул показывает, что волновое число полос меняется в меньшей степени, чем их интенсивность. Можно рассчитать интенсивности полос в ИК-спекфе макромолекул с различной степенью ориентации. Кроме того, для полиметилметакрилата и полиэтилентерефталата выделены полосы, чувствительные к степени упорядоченности различных фрагментов макромолекул [33]. [c.231]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенньгх участках (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора фрагментов. Если пропустить хромосомную ДНК через шприц с иглой малого диаметра или обработать ее ультразвуком, то мы получим фрагменты длиной от 0,3 до 5 т.п.н. К сожалению, в ходе этих простых операций разрывы двухцепочечных молекул происходят случайным образом, так что при каждой обработке препарата ДНК получается совершенно новый набор фрагментов. Молекулярное клонирование стало возможным только после вьщеления высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рест-рицирующими эндонуклеазами типа II. [c.50]

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, уз-наюшей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является БаиЗМ, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты всевозможных размеров (рис. 4.10). Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. В результате в распоряжении исследователя оказьшается неполная библиотека, что может затруднить или даже сделать невозможным обнаружение искомой [c.63]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология