Гибридомные клетки клонирование

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гибоидные клетки. [c.109]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

Из разных способов клонирования наиболее широкое распространение получил метод предельных разведений, когда стремятся получить одну гибридомную клетку на ячейку платы с вероятностью в 63%, что следует из распределения Пуассона f(0) = е , где f(0) — число ячеек без роста, Я, — среднее число клонов на ячейку, е — основание натурального логарифма при Я,-1 значение f(0) [c.576]

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лун- [c.140]

Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Д. Паркс с сотр. (1979) предложили модификацию проточного цитофлуориметра, позволяющую осуществлять клонирование индивидуальных клеток. Для этого приготавливают флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что позволяет выделять их на этом приборе. [c.110]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

Клонирование лучще всего проводить или на ранней стадии, чтобы не допустить вытеснения медленно растущего клона клетками быстрорастущих соседних клонов, или на конечной стадии, когда получена стабильная линия антителообразующих клеток. В последнем случае клонирование, как правило, лищь формально подтверждает моноклональность. Если до стадии продукции антител клонирования не проводили, то его необходимо осуществить позднее, в том числе и с уже клонированными линиями. Цель такого подхода — удаление непродуцирующих антитела клонов, которые иногда образуются после длительного культивирования. Если данные клоны не отделить в процессе последующего клонирования, то они могут постепенно вытеснить другие антителообразующие клоны. Некоторые линии чрезвычайно стабильны и не требуют повторного клонирования. У других гибридомных линий изменяются ростовые характеристики и антителообразующая активность. В этом случае иногда целесообразно повторное клонирование, но некоторым линиям свойственна нестабильность. Поэтому сразу после клонирования линии клеток следует немедленно заморозить (по меньшей мере 10 ампул) в жидком азоте. Ими можно будет воспользоваться, если клонированная линия окажется нестабильной при дальнейшем культивировании. [c.138]

Страхование клеточного материала осуществляют с помощью )иоконсервации. На всех этапах гибридомной технологии (тестиро-шия, клонирования) клетки дополнительно размножают и замора-ивают в жидком азоте. [c.203]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология