Клонирование индивидуальных генов

Достижения генной инженерии, сделавшей возможным выделение и клонирование индивидуальных генов, а также изучение первичной структуры ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции, методов секвенирования (см. гл. 15) сильно поколебали представления об универсальности структуры гена. Теория гена вступила в очередной критический период. [c.476]

Геномная библиотека (банк генов) представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Фрагментация целого генома на отдельные участки значительно облегчает все генно-инженерные манипуляции и позволяет анализировать отдельные последовательности, проводить сравнительный анализ различных геномов по определенным участкам и, главное, выделять и работать с индивидуальными генами. [c.41]

Рис. 10.3 Схемы клонирования чужеродных генов, позволяющие получать гибридные (я) или индивидуальные (б) белки.

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Прогресс в расшифровке генетических механизмов, контролирующих индивидуальное развитие, зависит от возможности использования удобных генетических моделей. Это означает, что процесс индивидуального развития необходимо разложить на элементарные признаки — фены, наследующиеся по альтернативной схеме. В этой главе было приведено несколько примеров таких моделей. Большие надежды вселяет применение новейших методов исследования, связанных с клонированием клеток и генов, возможность получения целых организмов из отдельных соматических клеток. [c.437]

Метод клонирования широко используют для выделения индивидуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зондами Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках Пример анализа по Саузерну (по англ southem-blotting — промокание по Саузерну) показан на рис 67 Аналогичный подход применим и д 1 анализа РНК (метод Нозерн -блотинга) [c.194]

Одно из основных применений техники клонирования-выделение индивидуальных генов непосредственно из генетического материала. Каждый индивидуальный ген представляет собой только очень небольшую часть эукариотического генома. Например, размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 10 п.н., так что один ген размером, скажем, 5000 п. н. составляет только 0,00005% всей ядерной ДНК. Для идентификации столь незначительного количества материала необходимо иметь высокоспецифичный зонд, взаимодействующий только с определенными, интересующими исследователя последовательностями, чтобы выделить их из огромного количества других последовательностей. Обычно применяемый метод состоит в использовании высокомеченых радиоактивных РНК- или ДНК-зондов, гибридизация которых с геном регистрируется с помощью радиоавтографии. [c.242]

Ретровирусы оказались очень полезным инструментом современных генно-инженерных исследований. Они служат источником для получения практически чистой обратной транскриптазы - фермента, играющего важнейшую роль в многочисленных работах, основанных на клонировании эукариотических генов (см. гл. 9). Так, очищенную индивидуальную мРНК, кодирующую интересующий нас белок, как правило, выделить гораздо легче, чем фрагмент ДНК генома, кодирующий тот же белок. Затем с помощью обратной транскриптазы можно получить ДНК-копию этой мРНК и встроить ее в подходящую плазмиду для клонирования и наработки значительных количеств нужной ДНК. В дальнейшем мы еще вернемся к обсуждению этих методических подходов. [c.51]

Клонирование отдельных генов или наборов генов стрептококков и изучение их экспрессии в гомологичном внутриклеточном окружении позволит глубже понять регуляцию функционирования этих генов, выявить индивидуальные особенности различных видов бактерий рода Strepto o us. [c.275]

Первичная структура рибосомной 23S РНК Е. соИ также была установлена как ее прямым химико-энзиматическим анализом, так и путем секвенирования ДНК ее клонированного гена (рис. 44). Одновременно и некоторое время спустя были секвенированы также высокополй-мерные РНК большой рибосомной субчастицы ряда других организмов, а также хлоропластов и митохондрий, которые дали материал Для сравнительно-эволюционного анализа. Весь арсенал методов, примененный в случае 16S РНК, был использован для изучения вторичной структуры 23 S РНК, и были найдены принципиально те же закономерности и особенности. Схема модели вторичной структуры 23S РНК Е. соН дана на рис. 45. Как и в 16S РНК, около половины или более остатков цепи 23S РНК оказываются вовлеченными в двойные спирали. Всего можно насчитать несколько более 100 индивидуальных спиралей. Наиболее ярким отличием от 16S РНК является, по-видимому, комплементарное спаривание 5 -конца 23S РНК с ее З -концом довольно стабильная совершенная двойная спираль из 8 пар нуклеотидов удерживает оба конца вместе, в значительной мере фиксируя общую свернутость цепи в конечную компактную структуру. Как и в 16S РНК, пары G U не редкость в спиралях 23S РНК. Кроме того, в спиралях имеются пары G А и, [c.77]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Геномная библиотека, банк (библиотека) генов (Genome lihrary) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме (млекопитающие), то получают хромосомоспецифичные библиотеки. [c.546]

Для гибридизации с зондом достаточно, чтобы клоны геномной ДНК содержали только часть комплементарной ему последовательности (обычно считают, что минимальный размер клонированной последовательности должен составлять около 50 п. н.). На практике, когда эукариотический ген имеет значительный размер, при создании библиотеки он может оказаться фрагментированным, так что разные участки гена окажутся в разных клонах, гибрвдизующихся с зондом. Полную нуклеотидную последовательность, соответствующую зонду, может не содержать ни один из клонов геномной ДНК. В этом случае необходимо реконструировать исходную геномную последовательность, используя наличие перекрываний индивидуальных фрагментов, которые, по всей видимости, имеют разные концы. [c.244]

ДНК каждого клонированного гена из обоих кластеров транскрибируется РНК-полимеразой II в системе транскрипции in vitro на основе экстракта культуры опухолевых клеток человека. Это свидетельствует о том, что каждый ген представляет собой индивидуальную транскрипционную единицу. Более того, транскрипция in vitro всех зародышевых, эмбриональных и зрелых генов, за исключением S-глобинового гена, происходит с сопоставимой эффективностью. Таким образом, регуляция транскрипции глобиновых генов в ходе развития, вероятно, определяет- [c.230]

Техника рекомбинантной ДНК открыла еще одну возможность в освоении пути экспрессии клонированных генов вируса гриппа в прокариотах и эукариотах. Эти исследования имели две основные цели 1) получение больших количеств чистых поверхносд -ных антигенов (НА и КА) применительно к проблеме их дальнейшего использования в качестве вакцин 2) изучение в клетках прокариотов и эукариотов биосинтеза, структуры и функции индивидуальных белков вируса гриппа дикого типа или мутантов. Поскольку эти белки в естественных условиях кодируются геномом минус-цепочечной РНК, ранее было невозможно управлять их первичными структурами путем направленных изменений кодирующих их последовательностей нуклеотидов. [c.161]

Описанные ранее системы клеток эукариотов обеспечивают только-кратковременную экспрессию генов-спутников (passenger genes) либо потому, что клетки-хозяева погибают вследствие литической инфекции, либо потому, что химерные геномы только кратковременно присутствуют в клетках. Линии клеток, которые непрерывно экспрессируют индивидуальные клонированные гены вируса гриппа, могут обеспечивать более удобный источник белка. Более того, используя активность слияния НА, они могут привести к развитию систем для доставки экзогенных генов и белков к клеткам. И наконец, они открывают путь исследованиям в области регуляции цитотоксических Т-клеточных ответов на вирусспецифические поверхностные антигены. [c.177]

Описанные в данной главе эксперименты свидетельствуют в пользу использования in vitro мутагенеза клонированных генов НА для изучения функции гидрофобных областей белка. Существуют многочисленные возможности распространения этой технологии на другие участки молекулы, включая пептид слияния, антигенные сайты, сайт связывания рецептора и точки прикрепления углевода. Точный анализ роли индивидуальных аминокислот в структуре и функции белка может быть проведен при введении изменений в одном основании в определенных сайтах в гене НА с использованием олигонуклеотидуправляемого мутагенеза [32]. Хотя подобные эксперименты будут особенно уместны для нашего анализа молекулы НА, эти дополнительные результаты весьма ценны для понимания структуры и функции цельных мембранных белков в общем смысле. Не говоря об особенных свойствах, связанных с антиген-ностью и биологическим значением, структура молекулы НА характерна для основного класса клеточных мембранных белков. Более того, поскольку биосинтез НА включает ферменты клетки хозяина и процессы во время трансляции, мембранного транспорта, гликозилирования и созревания, НА представляет собой полезную модель для изучения мембранных белков и органелл. [c.184]

Уникальную возможность для исследования экспрессии генов в индивидуальных нейронах представляет ЦНС брюхоногих моллюсков, состоящая из небольшого числа ( -2-10 ) крупных, во многих случаях легко идентифицируемых нейронов, сосредоточенных в нескольких ганглиях (R. S heller et.al., 1984). У аплизии некоторые нейроны достигают размеров 0,5 мм и содержат -0,25 мкг ДНК и 5 нг поли(А) РНК, что вполне достаточно для анализа методами молекулярного клонирования. [c.27]

Для максимизации экспрессии существенным является соблюдение оптимального расстояния межд> SD-сайтом и инициирующим кодоном. Показано, что расстояние в 9 п. о. оптимально при экспресии лейкоцитарного оА (о2) и фибробластного интерферонов. Выход резко меняется при изменении расстояния. Так, для -интерферона выход составляет (%) 0.4 при расстоянии 2 п. о., 50 при 8, 1.6 при 15 п. о. (оптимум 100% — 9 п. о.). Вероятно, эти различия связаны с образованием вторичной структуры РНК ( шпильки ) и, следовательно, зависят от последовательностей клонированного гена, окружения SD-сайта и состава кодонов между SD и ATG. Таким образом, структура сайта связывания с рибосомами должна оптимизироваться для каждого нового гена индивидуально. В целом вариации структуры сайта связывания с рибосомами могут дать изменение экспрессии приблизительно в 10 раз. [c.195]

Важнейшую роль в структурных исследованиях генома играет изучение его полиморфизма. Этот раздел молекулярной генетики является основой для понимания принципов молекулярной эволюции, механизмов возникновения патологических мутаций, для оценки факторов риска при воздействии потенциальных токсических агентов окружающей среды на человеческий организм, наконец, для понимания основ различной индивидуальной восприимчивости лекарств. Эти исследования получили новый импульс с открытием полиморфных мини- и микросателлитов, которые позволили осуществить тонкое генетическое картирование генома и в конечном счете создать интегрированные карты генома, объединяющие физические и генетические карты генома человека в единую систему. Это в свою очередь привело к развитию методов позиционного клонирования, которые позволяют быстро клонировать гены, начав с исследования их сегрегации в семьях. [c.7]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование индивидуальных генов: [c.191] [c.171] [c.268] [c.81] [c.86] [c.171] [c.332] [c.112] [c.371] [c.335] [c.323] [c.210] [c.293] [c.322] [c.137] [c.137] [c.322] [c.161] [c.188] [c.276] [c.333] [c.333] [c.336] [c.366] [c.412] [c.447] [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология