Гибридомы слияние клеток

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Второе направление развития Б. связано с клеточной инженерией. Культура растит, клеток может служить прежде всего источником свойственных данному растению вторичных продуктов, напр, антиаритмич. алкалоида ай-малина из раувольфин змеиной. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на спец. средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения оезвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм с нужными св-вами. Животные клетки более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят т. наз. гибридомы, полученные в лаборатории путем слияния двух различных клеток и служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений. [c.290]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Еще с прошлого столетия известно, что моча больных, страдающих этим заболеванием, часто содержит необычные белки, названные белками Бенс-Джонса по имени английского врача, который их впервые описал. Однако только в 1950-х годах выяснилось, что эти белки представляют собой свободные L-цепи иммуноглобулина. Первоначально детальная структура антитела была определена путем изучения миеломных белков из мочи или крови больных или же белков от мышей, у которых были целенаправленно индуцированы аналогичные формы рака. Впоследствии появилась возможность делать В-клетки, секретирующие антитела, бессмертными путем их слияния с клетками миеломы, не секретирующими антитела. Образующиеся гибридомы стали удобным источником моноклональных антител, которые можно получить против любого желаемого антигена в неограниченном количестве (разд. 4.5.4). [c.238]

Один из результатов использования метода слияния клеток млекопитающих чрезвычайно быстро нашел применение в биотехнологии это линии клеток, полученных при гибридизации с участием клеток миеломы (так называемые гибридомы ), с помощью которых могут вырабатываться моноклональные антитела. Этот метод, разработанный в Кембридже Мильштейном и его сотр., основан на создании бессмертных клеток, производящих антитела, за счет слияния их с клетками миеломы. [c.313]

В результате гибридизации удается получать гибриды клеток с хозяйственно ценными свойствами. Пока практически единственный пример таких гибридов — это гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела [6]. Однако можно ожидать создание линий гибридных клеток, обладающих способностью продуцировать другие ценные биологические вещества. Получение таких линий может быть достигнуто путем слияния дифференцированных клеток-продуцентов ценных веществ с опухолевыми клетками, имеющими такое же происхождение, что и клетки-продуценты. [c.176]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке. [c.166]

Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты). Синтезируются гибридомами - клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой, способной к неограниченному росту. Некоторые мие- [c.553]

Рис. 2. Прямой анализ продуктов, секретируемых гибридными клетками. Культуры гибридом получали, проводя слияние спленоцитов мышей, иммунизированных линией опухолевых клегок человека, с клетками мышииой мне ломы Х63-Аё8. Взвесь, содержащую 5-10 клеток гибридомы в 1 мл, культивировали в течение ночи в полной среде для тканевых культур в присутствии 100 мкКи/мя 5-метионина. Культуральную жидкость центрифугировали 15 мин при 20 000 Затем 100 мкл надосадочной жидкости смешивали перед ДСН-ПАГЭ с 50 мкл 3-кратного концентрата ДСН-буфера для образца. На гель наносили пробы по 50 мкл. Электрофорез проводили при постоянном токе 25 мА на пластинку геля в течение 3,5 ч. Т и Л —соответственно тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов 1 и — окрашенные элек трофореграммы и радиоавтографы одних и тех же образцов. Стрелками указаны легкие цепи пмм ко лобулино8, кодируемые геномом клеток Х63-Ай8.

Первые успехи в изучении строения иммуноглобулинов были связаны с изучением иммуноглобулинов, полученных от больных миеломой (см. 1.4). Как уже говорилось, у таких больных в результате присутствия одного злокачественно разросшегося клона В-лимфоцитов вырабатывается огромное количество индивидуального иммуноглобулина, который сравнительно леп о отделить от всех остальных. Дальнейшие успехи в получении индивидуальных антител связаны с достижениями клеточной биологии, позволившими осуществлять слияние клеток миеломы как носителей способности к неограниченному размножению с нормальными В-лимфоцитами как носителями программы для выработки антител определенной, задаваемой экспериментатором специфичности. Получающиеся клетки, гибридоми сохраняют способность к неограниченному размножению и вырабатывают индивидуальные антитела. Так как в этом случае гибридомы происходят от одной исходной слитной клетки, то они представляют собой единый клон получающиеся из них антитела называют поэтому моноклональными антителами. [c.39]

Выбор сыворотки. Отбору сыворотки необходимо уделять особое внимание. Сыворотки из различных источников сильно варьируют по свойствам. Надо проверять также каждую партию сывороток. Наибольшей способностью поддерживать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Чаще всего используют неинактивнрованную сыворотку, хотя некоторые исследователи предпочитают инактивировать ее прогреванием при 56°С в течение 30 мин для уменьшения возможной токсичности компонентов комплемента. СПК является одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому с ней необходимо обращаться весьма экономно. Для культивирования клеток сразу после слияния, а также для клонирования используют высокую концентрацию СПК (15—20%). Как только гибридомы отобраны, их можно постепенно переводить иа рост в 10% СПК. Если клетки хорошо адаптировались, то концентрацию СПК можно снизить до 5%. [c.98]

Гибридомы человека получают аналогично гибридомам мыши. В большинстве случаев сливают с помощью ПЭГ активированные В-клетки либо с миеломными клетками, дефективными по ГГФРТ, либо с клетками, у которых нет этого дефекта, применяя в данном случае селективную среду с диэтилпирокарбо-натом. Для индукции слияния некоторые исследователи используют электрический разряд. [c.120]

Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень антител (50 НГ — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может быть связано с особенностями родительских миеломных линий человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее время линии человека не являются истинными плазматическими клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клеткам. [c.120]

Гкбридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния антителопродуцирующей клетки с миеломной, активно пролиферирующей клеткой, у которой отсутствует собственный синтез иммуноглобулинов гибридома образует высокоаффинные антитела узкой специфичности. [c.460]

Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях После слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл. [c.165]

Гибридомы получают путем слияния трансформированных (опухолевых) плазматических клеток с нормальными лимфоидными клетками. В гибри-домах происходит экспрессия генов нормальных клеток. [c.66]

В 50-е гг. Вернет, Ерне, Ледерберг и Тол1мейдж постулировали, что каждый В-лимфоцит запрограммирован на синтез антител одной определенной специфичности, относящихся к тому же идиотипу, что и молекулы, экспрессированные на поверхности данного лимфоцита в качестве антигенных рецепторов. В настоящее время это положение убедительно доказано. Если животное иммунизируют каким-либо антигеном, то начинается клональная экспансия и дифференцировка тех В-лимфоцитов, которые распознают этот антиген. В результате образуются плазматические клетки, которые продуцируют антитела. Если бы индивидуальные антиген-реактивные клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного удалось длительное время поддерживать в культуре, то надосадочная жидкость содержала бы однородные молекулы антител (моноклональные антитела), которые были бы способны распознавать только один или несколько близкородственных антигенов. К сожалению, потомство индивидуального реактивного лимфоцита не удается длительное время выращивать в культуре для получения больших количеств моноклональных антител (МКА). Впервые эта проблема была решена Келером и Мильштейном в 1975 г. [1]- Исследователям удалось трансформировать антителообразующие лимфоциты путем слияния их с клетками иммортализованной клеточной линии с последующим клонированием индивидуальных гибридных клеток. Таким образом были получены линии гибридных клеток (гибридомы), каждая из которых продуцировала молекулы антител одного и того же идиотипа. [c.116]

Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае гибридомы выращивают в 24-луноч-аых панелях для культуры тканей (объем лун ки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как удоб- [c.123]

Панели следует ежедневно просматривать под инвертированным микроскопом. В течение первых двух дней, как правило, можно наблюдать ли1иь отдельные клетки (по размеру и морфологии сходные с плаэмацитомными) на фоне сгруппированных клеток селезенки. На четвертый день, если гибридизация прошла успешно, в некоторых лунках должны появиться небольшие колонии гибридомы. К пятому дню, когда в лунки дополнительно добавляют среду, в некоторых из них должны ВЫЯВЛЯТЬСЯ большие колонии гибридом, которые на 7-й день ДОЛЖНЫ быть заметны уже в 20—100% от общего числа лунок. К этому времени выкившие клетки селезенки образуют скопления, которые могут интенсивно расти и угрожать выживанию медленно растущих гибридом. Успешная процедура слияния требует не только хороших условий для. слияния клеток и обогащенной среды, стимулирующей рост, но и подавления роста сохранивших жизнеспособность клеток селезенки. К последним могут относиться макрофаги, фибро- бласты, предшественники тучных клеток 12] и лимфоциты. [c.128]

Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования, то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2 мл. Далее при образовании монослоя и окращивания среды в желтый цвет, супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который отличается наилучщим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно получает преимущество над всеми другими в культуре. [c.138]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Для получения гибридомы, образующей антитела N 5/1, мышей иммунизируют перевиваемыми лимфобластами человека, берут клетки мышиной селезенки и проводят их слияние с клетками мышиной миеломы, а затем отбирают полученные гибриды. В качестве реагента, содержащего моноклональные антитела, используют разбавленный 1 10 нли 1 20 супернатаит среды, в которой культивировалась данная линия гибридных клеток. Чтобы избежать спонтанного Т-клеточного розетирова-иия, образование розеток с участием моноклональных аитнтел к DR-антнгенам проводят с эритроцитами быка (ЭБ), а ие барана. [c.202]

Обычно молекулы антител содержат по два идентичных центра связывания. С использованием техники получения моноклональных антител удалось создать уникальную конструкцию, которая представляет собой молекулу антитела с двумя неидентичными центрами связывания (Martinis et al., 1982) (рис. 24-7). Было проведено слияние клеток гибридомы, продуцирующей мышиные моноклональные антитела против кислой фосфатазы простаты (КФП), с клетками селезенки мыши, иммунизированной поверхностным антигеном вируса гепатита В. Выделенные моноклоны обладали способностью связываться одновременно с обоими антигенами. Антитела, продуцируемые одним из клонов, удалось разделить хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе на 3 фракции. Было показано, что одна из этих фракций содержит антитела, специфичные только к КФП, другая — антитела, специфичные к поверхностным антигенам вируса гепатита В, [c.396]

Новые колоссальные возможности для иммунохимических исследований появились в последние годы, когда было обнаружено, что соматические гибридные клетки, полученные от слияния in vitro клеток миеломы с другими клетками-продуцентами антител, наследуют от первых способность пролиферировать, а от вторых — способность к синтезу специфических для них антител. Таким образом, миеломные клетки передают гибриду свою способность делиться и вести интенсивный синтез иммуноглобулинов, в то время как генетическая информация для этого синтеза поступает от обеих клеток-—миеломной и ее партнера по гибриду. Такие гибридные клетки ( гибридомы ) могут размножаться in vitro, вырабатывая большие количества антител. Их можно размножить и путем трансплантаций в организме мыши. Мало того, удается отобрать такие исходные варианты миеломы или такие продукты гибридизации, что синтез собственных мие- [c.104]

Получение mAb. Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb (Г. Колер и С. Мильштейн, 1975 г.), как и всё гениальное, очень проста сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секре-тирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела. [c.404]

Значительная часть Т-клеток, экспрессирующих цепь vpe.l, распознает антиген Mls-1 . Путем слияния Т-лимфобластов (экспрессирующих vp8.1 или Vp8.2), выделенных из лимфатических узлов мышей линии B10.br (М1а-1 ), с вариантом Т-клеточной тимомы BW5147 (не экспрессирующей ни Va, ни vp) были получены Т-клеточные гибридомы. Клетки-гибриды отделяли при помощи скрининга с использованием антител, распознающих vpe.l и (для сравнения) VP8.2, затем исследовали реактивность гибридом в отношении антигенов Mls-1 на поверхности клеток-стимуля-торов Н-2 . Подавляющее большинство гибридом, реагирующих на антиген Mls-1 , экспрессировало VP8.1 и незначительное - VP8.2. Эти результаты показывают, что в распознавании антигена Mls-1 главную роль играет цепь vp8.1. [c.251]

Гибридомы — гибридные лимфоидные клетки, полученные путем слияния опухолевой миеломной клетк , с нормальными лимфоидными клетками иммунизированного животного или человека. [c.494]

Проблему гетерогенности антисыворотки удалось преодолеть в 1976 г. после разработки нового метода, который произвел революцию в исследовании внутриклеточных процессов с помощью антител. Этот метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только один определенный тип антител, что обеспечивает получение однородных антител в большом количестве. Время жизни В-лимф оцитов в культуре обычно весьма ограничено. Поэтому от иммунизированных мышей получают В-лимфоциты, секретирующие отдельные виды антител, и осуществляют их слияние с бессмертными клетками из опухоли В-лимфоцитарного происхождения. В результате образуется гетерогенная смесь гибридных клеток, из которых отбирают гибриды, способные размножаться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти так называемые гибридомы клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является постоянным источником моноклональных антител одного типа (рис. 4-59). [c.226]

Метод генетической инженерии позволяет также заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. До последнего времени диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров. В настоящее время этот дорогой и непростой способ вытесняется гибридомной техникой получения антител. Эта техника основана на получении клеток-гибридом путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных и миеломных (раковых) клеток. Образующаяся гибридная клетка (гибридома) обладает способностью миеломной клетки быстро размножаться на искусственных питательных средах [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология