Клонирование клеток в мягком агаре

Эффективность клонирования клеток в монослое, как правило, выше, чем в мягком агаре, поэтому этот метод часто используется при работе с линиями клеток. Нормальные и опухолевые клетки могут образовывать колонии в монослое, так что этот метод неприменим к биопсипному материалу опухолей, который обычно характеризуется высоким уровнем примесей клеток стромы. Метод клонирования в монослое биопсий опухолей [c.273]

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лун- [c.140]

Для клонирования постоянных линий клеток применения этих методов, как правило, не требуется. Так, разведенная суспензия клеток HeLa (примерно 100 клеток в 5 мл) может быть использована для получения колоний, возникающих из единичных клеток. Важно лишь предотвратить передвижение этих клеток (приводящее к смешиванию клонов), для чего клетки иногда покрывают мягким агаром. [c.89]

Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар (Р. offino и сотр., 1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара. [c.110]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Ксеногенная иммунизация животных клонированными популяциями жизнеспособных клеток лимфомы приводит к активации и увеличению числа клеток, способных продуцировать антитела к чужеродным антигенам мышиных лимфом. С помощью соматической гибридизации получают иммортализованные антителосинтезирующие клоны и из них отбирают (тестируя антитела на способность связываться с клетками) только те, которые секретируют антитела против антигенных детерминант клеточных поверхностей. Культуры, которые содержат клетки, продуцирующие МА, клонируют в мягком агаре и подвергают повторному тестированию на способность связываться с клетками большого числа линий, представляющих различные стадии и направления дифференцировки. [c.176]

Для клонирования с помощью лимитирующих разведений 33 клетки из колонии на мягком агаре вносят в 10 мл среды и затем разливают в лункн панели для микротитроваиия с QS плоскодонными лунками (№ 3396, ostar). В каждую лунку предварительно помещают облученные (3300 Р) клетки-стимуляторы (ЫОв) и 100 мкл 10% Ной надосадочной жидкости из культуры, стимулированной Кон-А. Культивирование проводят, как описано выше, и за ростом культуры следят с помощью-микроскопа. Нет необходимости в добавлении свежей среды. [c.310]

Для клонирования клеток обычно используют среды, содержащие 0,3% агара (0,3%-ный раствор атара иногда называют мягким , а 0,5%-ный — твердым последний используют для приготовления нижних, или питательных, слоев, когда важно жестко иммобилизовать клетки. Однако при таких высоких концентрациях агара клеточный рост сильно подавляется. Добавляют 1 г агара (Бактоагар Dif o) к 100 мл дистиллированной воды и кипятят в колбе Эрленмейера. Этот раствор помещают в водяную баню при 43°С при такой температуре раствор агара не застывает. (Образование геля происходит при комнатной температуре. В таком виде его можио хранить. Перед использованием агар растапливают, поместив на кипящую водяную баню.) [c.392]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология