Получение чистых антител

Большие возможности совершенствования промышленной биотехнологии заключены в развитии и интенсификации не только основной стадии — ферментации, но и последующих этапов разделения, очистки и получения товарных форм препаратов. Здесь прогресс крупнотоннажного микробиологического синтеза связан с грамотным применением и модификацией известных процессов химической технологии, таких, как разделение суспензий, выпарка, сушка, ионный обмен, кристаллизация, экстракция и особенно мембранные методы ультрафильтрации, обратного осмоса, диализа и т. п. Отметим, однако, что биотехнология должна и уже начала развивать свои специфические методы выделения биологически активных веществ, основанные на биологических взаимодействиях. Например, чрезвычайно перспективна хроматография культуральных жидкостей на носителях, несущих антитела к имеющемуся в растворе антигену, что позволяет выделить чистый биопрепарат из растворов практически любой концентрации и сложности. [c.139]

Очистка антител. Осуществляется с помощью сефарозы, активированной бромцианом, к которой присоединяются различные антигены, такие, как белки, вирусы или альбумин бычьей сыворотки, связанные с гаптенами метод является наилучшим для получения чистых антител. [c.218]

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ АНТИТЕЛ [c.532]

Для выявления молекул клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии, белки плазматической мембраны солюбилизируют, отделяют друг от друга и каждую фракцию испытывают на способность нейтрализовать действие фрагментов антител, блокирующее агрегацию клеток (этапы 3 и 4). Затем фракции, проявившие такую способность, очищают и вновь тестируют до тех пор, пока не будет получен чистый белок (этот процесс на схеме не показан). Другой Иммунологический подход состоит в получении большого числа моноклональных антител (разд. 4.5.4) к антигенам клеточной поверхности и их скрининге для выявления тех, которые будут блокировать межклеточную адгезию. Оба иммунологических метода основаны на важном общем наблюдении простое нанесение на клеточную поверхность антител само по себе не препятствует нормальной клеточной адгезии адгезия блокируется только тогда, когда мишенями для связывания антител служат специфические молекулы клеточной [c.518]

Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител (МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в аффинной хроматографии — вначале для очистки антигенов клеточной поверхности [И, 12], а затем для выделения множества других белков [13, 14]. [c.165]

Основное преимущество метода гибридом определяется возможностью получения моноклональных антител против неочищенных молекул, содержащихся в сложной смеси в качестве минорного компонента. Это преимущество обеспечивается реальностью выбора индивидуальных гибридом, образующих антитела определенного вида, из сложной смеси различных гибридных клеток, продуцирующих множество разных антител. Таким образом в принципе можно получить моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке. Каждый тип антител можно затем использовать в качестве специфического зонда как для локализации белков с помощью цитологических методов, так и для очистки белков. Получив белки в чистом виде, мы можем исследовать их структуру и функцию. К настоящему времени выделено не более 5% из 1000 или более различных белков, которые, судя по имеющимся данным, содержатся в типичной клетке млекопитающих. Использование моноклональных антител и технологии клонирования генов (см. ниже) снимает многие сложности в идентификации и определении новых белков и генов. Проблемой для исследователей остается определение их функций. [c.227]

Применение химерных белков В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовать, является сам химерный белок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. Чтобы рещить эту задачу, можно встроить в подходящий вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела. Образующийся в результате химерный белок и будет служить антигеном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирующем белке, и тогда останутся только антитела, связывающиеся с нужной аминокислотной последовательностью. [c.113]

Своеобразие рассматриваемых процессов состоит также в том, что. конечный продукт, находящийся первоначально в очень сложной смеси растворенных в воде веществ, должен быть получен со степенью чистоты, определяемой его последующим применением, т. е. с чистотой фармакопейных препаратов. Такая задача была бы крайне трудной, если бы не возможность использования специфических антител. Действительно, промышленное производство моноклональных антител из культур клеток, полученных методами клеточной инженерии (гибридомная техника), оказалось тем биотехнологическим производством, которое дало гигантский эффект в методах выделения особо чистых биопрепаратов. Иммобилизация моноклональных антител,. специфическим антигеном которых является, например, аг-интерферон, позволяет выделять последний в чистом виде из жидких смесей любого состава, пропуская их через колонку, в которой целевой продукт задерживается на твердом носителе, несущем антитело, а все остальные компоненты раствора, не дающие реакции антиген—антитело , проходят неизменными. После промывки комплекс интерферона с антителом легко разрушается и продукт получается в чистом виде. [c.28]

Если иммуносорбент с иммобилизованными антителами предполагают использовать прежде всего для извлечения из смеси определенного антигена (но не для получения его в чистом виде), фиксацию антител можно осуществить по типу сэндвича . Первоначально иммобилизуют на носителе такой же антиген пли антиген, перекрестно с ним реагирующий, а затем к иммуносорбенту добавляют большой избыток антител (антисыворотка). Часть активных центров антител, присоединенных к иммобилизованному антигену, окажется свободными. Именно за счет них сэндвич -сорбент будет связывать определенный антиген из раствора. [c.243]

С развитием гибридомной технологии вновь появилась надежда на то, что антитела можно будет использовать в качестве терапевтических средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспецифичных антител в организме. Однако остаются проблемы, связанные с риском развития перекрестных реакций, приводящих к развитию иммунного ответа и анафилаксии ведь в организме больного могут вырабатываться собственные антитела на детерминанты моноклональных антител мыши. Поэтому основная задача в настоящее время состоит в том, чтобы разработать методы получения моноклональных антител человека, обладающих как специфическими иммунотерапевтическими свойствами, так и пониженной иммуногенностью. [c.211]

Несмотря на сравнительную простоту аффинной очистки антител, обратная процедура, а именно очистка антигена на колонке с иммобилизованными антителами, была, как правило, неэффективной. Дело в том, что для получения специфической антисыворотки обычно требуется чистый антиген, а его легче очистить традиционными методами, чем при помощи колонки с иммобилизованными специфическими поликлональными иммуноглобулинами. Одна из причин неэффективности колоночной очистки в данном случае заключалась в том, что специфические антитела составляют весьма незначительную долю всех иммобилизованных иммуноглобулинов. [c.164]

Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет важное значение при постановке диагноза первичной и врожденной инфекций. Существует множество методов определения и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти методы заменены чисто иммунологическими методами, которые не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два основных варианта этих методов. Первый предполагает идентификацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса краснухи связывают с поверхностью пластика (например, дном лунки 96-луночного планшета), инкубируют его с сывороткой пациентов, а затем с меченными антителами против IgM человека, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после [c.327]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

Для решения вопроса о том, являются ли антитела сывороточными глобулинами или же они только связаны с этой фракцией, можно использовать специфические методы очистки антител. Обычно эти методы включают два основных этапа 1) образование преципитата антиген—антитело и 2) диссоциацию преципитата и выделение чистого антитела. Первые успешные опыты этого рода были предприняты Фелтоном [42], который преципи-тировал антигенные полисахариды пневмококков соответствующей иммунной сывороткой, а затем разлагал преципитат, обрабатывая его гидроокисью бария. При такой обработке антитела переходят в раствор, нерастворимые же бариевые соли полисахаридов остаются в осадке. Гейдельбергер и его сотрудники успешно расщепляли подобные преципитаты, обрабатывая их концентрированными растворами хлористого натрия [43, 44]. В лаборатории автора для получения чистых антител преципитаты азобелков обрабатывались разведенными кислотами в присутствии нейтральных солей. При этом большая часть антител отщеплялась и переходила в раствор, а антиген и недиссоцииро-ванная часть антител оставались в осадке [45]. Растворы антител, полученные при помощи этих методов, содержат глобулины, не отличающиеся по свойствам от описанных выше нормальных глобулинов. Дальнейшие исследования показали, что больше 90% выделенных подобным образом глобулинов осаждается соответствующим антигеном. Это весьма убедительно подтверждает, что данные глобулины действительно идентичны с настоящими антителами. [c.336]

Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

Антисыворотки к подклассам IgA и IgG могут быть получены с помощью гибридомной технологии. Готовые к применению аффинно очищенные антитела могут быть использованы как в качестве им муногенов, так и в качестве сорбирующих антигенов. При этом простота в определении изотипов моноклональных антител сочетается с возможностью успешного получения специфической преципитирующей антисыворотки. Сыворотки получают, вводя животному интактные молекулы Ig илн F -фрарменты, затем их истощают на колонках со смесью других изотипов, содержащих как х-, так и Я-цепи. Получение чистого IgGaa мыши для иммунизации и адсорбции может быть осуществлено физико-химическими методами (разд. 10.6.1). [c.104]

Для очистки фрагментов и чистых антител, флуорохромированных кристаллическим ТРИТЦ, нередко бывает достаточно одноэтапной гель-фильтрации. Полученный с колонки элюат анализируют и обрабатывают далее, как указано в разд. II, Д и [c.170]

Приготовление реагентов. Чистый изофермент КК-ММ выделяли нз скелетной мышцы человека, как описано в работе (Usategui-Gomez et al., 1981). Для получения козьих антител проводили еженедельные подкожные инъекции препаратами, содержащими по 2 мг очищенной КК-ММ, эмульгированной в полном адъюванте Фрейнда. Перед использованием в анализе определяли титр антител по взаимодействию с очищенным препаратом КК-ММ, разведенным сывороткой человека (рис. 21-7). [c.327]

В каждой из отобранных таким образом лунок еще содержалось около 200 ООО клеток. В силу полиспецифичности иммунного ответа (см. выше) они еще не были моноклональны, поэтому далее клетки из этих лунок рассеивали ло одной, выращивали колонии и снова их сканировали, т. е. производили обычные операции клонирования, позволяющие в конце концов отобрать наилучший по заданным параметрам клон гибридом, образующих совершенно одинаковые <смоноклональные> антитела. Моноклональные гибридомы в суспензии вырабатывают 5—10 мкг антител на 1 мл среды. Однако полученные от чистых линий BALB гибридомы сохраняют присущую миеломным клеткам способность к опухолевому росту. Ими инокулируют мышей и после нескольких пассажей получают в асцитной жидкости моноклональные антитела в огромном количестве — до 50 мг чистых антител на мышь (титр 10 10 ). [c.115]

Выделение антигенспецифичных иммуноглобулинов осуществляют методом аффинной хроматографии. Антиген пришивают к частицам сефарозы и связавшиеся с ним чистые антитела элюируют с иммуносорбента хаотропными агентами (например, тиоцианатом натрия) или буферным раствором (глицин—H I или диэтиламина). Метод аффинной хроматографии применяют и для получения очищенных препаратов антигенов (рис. 29.15). [c.532]

Использование иммобилизованных антигенов позволяет выделить фракцию иммуноглобулинов, специфических антител против белка (рис. 4.ЮЛ). Полученный таким путем высокоочищенный специфический реагент может быть использован в случаях, когда Ьн требуется, как, например, в иммуногистологии. Существенным недостатком этих методов являются жесткие условия десорбции антител. Чтобы смягчить денатурирующий эффект от снижения pH до 2,8 (условие, нередко используемое для десорбции антител), десорбированные фракции необходимо собирать в буферном растворе, pH которого близок к нейтральному. В этих условиях восстановленные антитела обычно активны. В то же время, если иммобилизованный антиген чист, эта операция позволяет удалить неспецифические примеси антител, временами присутствующие во фракции иммуноглобулинов. [c.109]

Для проведения РИА гормонов, а также других лекарств или токсических веществ (возможности метода весьма широкие) необходимо иметь радиоактивно меченое исследуемое соединение и смесь сывороточных гамма-глобулинов, содержащих антитела к этому соединению. Идеальным случаем является использование чистых моноклональных антител, полученных с помощью гиб-рндомной методики. [c.315]

В целях получения лимфоиддых клеток животному (мыши) вводят внутримышечно или внутрибрюшинно антиген в дозе примерно 5- 200 мг в расчете на чистый белок. В ответ на сильный антиген в селезенке 0,05% клеток секретируют IgM и IgG в соотношении, близком 10 1 из примерно 1% всех секретирующих клеток. Через 3—4 недели повторно вводят 10—100 мкг антигена. В течение последующих 2—4 недель проверяют титры антител и затем перед экстирпацией селезенки в течение нескольких дней вводят внутривенно небольшие дозы антигена для активации В-лимфоцитов. Могут быть приняты и другае схемы иммунизации. [c.573]

Применение иммунологических методов в препаративных целях осложняется прочностью и специфичностью комплекса антиген— антитело. Некоторые комплексы можно разложить только с одновременной деструкцией одного из компонентов, обычно антигена при этом освобождается антитело [371—373]. Антитела против полисахаридных (пневмококковых) антигенов можно отделить [374—376] в концентрированном растворе Na l (1,8 М), причем получаются растворы антител различной степени чистоты. Как показывают результаты измерения содержания азота в осажденных антителах, степень чистоты таких растворов нередко приближается к 100% . Успех применения этого метода, повидимому, частично зависит от эффективности антисыворотки, применявшейся для преципитации. Антитела белковых антигенов, например дифтерийный антитоксин, не могут быть выделены при помощи такого простого метода. Оказалось целесообразным гад-ролизовать белковый антиген пепсином или трипсином в определенных условиях при этом удается выделить только 30—60% указанного антитоксина [377]. Сырой дифтерийный антитоксин, полученный в результате обработки трипсином, не является, как показывает проба на постоянство растворимости, чистым, хотя токсином можно осадить 95% его. Этот препарат был разделен [c.79]

В развитых странах каждый пятый человек умирает от рака, но вряд ли стоило бы только по этой причине посвящать ему здесь целую главу. Первое место по количеству вызываемых смертей занимают все-таки сердечно-сосудистые заболевания, да и многие другие болезни причиняют людям ничуть не меныпе вреда. Очень серьезную проблему для человечества представляют несбалансированное питание и инфекционные болезни. Важность изучения клеточной биологии рака в значительной мере обусловлена тем, что в основе родственных заболеваний, объединенных под этим названием, лежат нарушения наиболее фундаментальных законов поведения клеток в многоклеточном организме. Для того чтобы разобраться в сущности рака и разработать рациональные способы его лечения, необходимо понять как внутренние механизмы жизнедеятельности клеток, так и механизмы взаимодействия их друг с другом в тканях и организме в целом. Именно по этой причине фундаментальные исследования рака столь существенно обогатили наши знания о нормальных клетках. Ведь в ходе этих исследований были созданы эффективные методы, которые во многом определяли нынешнюю революцию в клеточной биологии. Достаточно назвать использование обратной транскриптазы из онкогенных РПК-содержащих вирусов и линий миеломных клеток (потомков раковых В-лимфоцитов) для получения соответственно кДПК (разд. 4.6.3) и моноклональных антител. Можно спорить о том, в какой степени огромные средства, брошенные на лабораторные исследования в этой области, способствовали выполнению основной задачи - развитию терапии рака, однако не подлежит сомнению, что стимулированный ими прогресс клеточной биологии значительно углубил наши знания в областях медицины, выходящих за пределы чистой онкологии. [c.445]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

Метод очень эффективно работает для всех антител класса IgG мыши, кроме подкласса IgGl. Эти последние антитела обладают очень низкой аффинностью по отношению к белку А. Поэтому для получения хорошего их выхода метод следует модифицировать. Очистка иммуноглобулинов других классов здесь не рассматривается, поскольку подавляющее большинство гибридом, получаемых в результате гипериммунизации и слияния, проводимых в соответствии с описанными методиками, продуцирует антитела класса IgG. Мы не советуем вам получать антитела нз асцитной жидкости (разд. 6.3.8), поскольку такие же количества антител, причем более чистых, могут быть получены прн использовании методов, описание которых приводится выше. [c.198]

Бессыворбточиые среды. В настоящее время наблюдается тенденция к производству моноклональных антител в средах с низким содержанием сыворотки или в бессывороточных средах, хотя публикаций о применении таких сред в промышленном масштабе очень немного. Преимущества таких сред по сравнению с обычными, содержащими 10 и более процентов сыворотки, заключаются в упрощении процесса и удешевлении продукции. В случае бессывороточных сред, кроме того, достигается более высокая воспроизводимость процесса, поскольку каждый компонент среды хорошо известен и может быть получен в очень чистом состоянии. HaKonen, бессывороточные синтетические среды полезны и в научно-исследовательских работах, поскольку в них можно селективно варьиромть концентрацию любого компонента. По сути дела, для проведения корректных научных исследований по росту гибридомных и других клеточных линий в первую очередь необходимо иметь хорошо охарактеризованную бессывороточную среду. [c.42]

Предназначенный для связывания иммуноглобулин должен (быть сравнительно чистым и в идеале состоять преимущественно из молекул специфических антител. Это не представляет проблемы при использовании МКА, полученных из асцитной жидкости и затем очищенных. В качестве препарата поликлональных антител лучше всего ис пользовать антитела, очищенные путем аффинной хроматографии, или по край ней мере фракцию иммуноглобулинов, полученную с помо-ддью (Ионообменной хроматографии (ам. гл. 2, разд. 10). Метод связывания с эритроцитами должен быть мягким, неденатурирующим, поскольку специфическая антигенсвязывающая способность антител очень лабильна.. Ниже приведены две наиболее распространенные и простые методики. [c.262]

Смотреть страницы где упоминается термин Получение чистых антител: [c.70] [c.178] [c.90] [c.211] [c.145] [c.167] [c.141] [c.141] [c.17] [c.293] [c.249] [c.518] [c.318] [c.134] [c.437] [c.330] [c.63] [c.50] [c.149] [c.94] [c.112]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология