Изоэлектрическое фокусирование в тонком слое

Важное значение имеет также плотность исследуемого раствора. Она должна быть равной или по крайней мере близкой к плотности ореды в месте его введения. В связи с тем что измерение плотностей жидкостей в малых объемах является трудоемкой процедурой, для создания условий, при которых исследуемый раствор и среда будут иметь одинаковую плотность,, применяются более простые методы. Свенссон и др. [1265] предложили в месте введения пробы создавать уступ плотности — крутой локальный градиент плотности. В этом случае достигается хорошее приближение к идеальной плотности пробы, так как она может быть любой в пределах плотностей верхнего и нижнего краев уступа . Обычно формирование слоя исследуемой пробы проходит успешно, если градиент плотности в месте ее внесения настолько крут, что расстояние между этим местом и слоем, имеющим одинаковую с пробой плотность, не превышает нескольких миллиметров. В этом случае раствор пробы почти лэминарно перемещается вверх или вниз до уровня равной с ним плотности и образует тонкую горизонтальную полосу. Если же градиент плотности слишком пологий и (или) расстояние между местом внесения пробы и слоем с равной плотностью велико, то перемещение пробы вплоть до достижения ею этого слоя будет сопровождаться конвекционными токами, ухудшающими качество стартовой зоны. Поскольку при электрофорезе в градиенте плотности в отличие от изоэлектрического фокусирования толщина стартовой зоны существенно влияет на качество разделения, правильное внесение пробы имеет исключительно важное значение. [c.27]

Было бы утомительно проводить серию электрофоретических опытов при различных близких друг к другу значениях pH. Разумной альтернативой такой постановки опыта служит электрофорез в градиенте pH. Этот вариант метода, называемый изоэлектриче-ским фокусированием, является прямым аналогом равновесного центрифугирования в градиенте плотности. Молекулы, несущие и положительные и отрицательные заряды, называют амфолитами к ним относятся, например, полимеры, содержащие многочисленные амино- и карбоксильные группы. Смесь амфолитов с широким спектром изоэлек-трических точек вводят в колонку и ожидают, пока она не распределится по колонке под действием электрического поля. Таким способом достигается стабилизация градиента pH, в котором каждый конкретный амфолит оказывается около своей изоэлектрической точки. Для того чтобы избежать потерь биологического материала на аноде или катоде, на обоих концах градиента устанавливают такие значения pH, при которых у биологических материалов не может быть изоэлектрических точек. Чтобы подавить конвекцию, градиент pH создают в твердотельном носителе. В эту систему добавляют небольшое количество белка. Он мигрирует, пока не достигнет pH, соответствующего его изоэлектрической точке. Там он и концентрируется, образуя узкую зону. Чтобы проанализировать результаты такого опыта, можно просканировать гель и измерить поглощение белка можно также окрасить белок либо нарезать гель на тонкие слои и измерить в каждом слое pH, содержание белка, ферментативную активность или радиоактивность. [c.302]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология