Фокусирование изоэлектрическое

Рис. 12.15. Схема прибора (фирма LKB) для изоэлектрического фокусирования со стабилизацией зон при градиенте плотности.

АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКОВ [c.98]

Три изоэлектрическом фокусировании в вертикальной колонке между анодом и катодом электрохимически создается градиент pH. Градиент pH стабилизируется градиентом плотности, чаще всего сахарозным вся система тщательно термостатируется. Белки в колонке движутся в направлении, соответствующем их изоэлектрической точке, где фокусируются в виде очень узкой полосы. Две соседние полосы могут быть разделены интервалом всего лишь в 0,01 единицы pH. Считается, что изоэлектрические точки белков в обычных экспериментальных условиях близки к их изоионным точкам, т. е. к тем значениям pH, при которых белки остаются изоэлектрическими в условиях полного отсутствия добавленного электролита [129]. [c.164]

Фракционирование белков можно осуществить методом изоэлектрического фокусирования. В этом случае электрофорез белков проводят в колонке со средой, в которой градиентно меняется значение pH. Там, где pH среды соответствует ИЭТ данного белка, он теряет заряд и перестает продвигаться вдоль колонки. Таким [c.122]

Хотя в настоящее время существуют методы определения изоэлектрической точки исследуемых белков с достаточной точностью (например, изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности сахарозы), знание изоточки вовсе не обязательно для выбора ионообменника. Пригодность того или иного ионита легко определить по степени связывания белка в статических условиях. В случае анионита смолу приводят в равновесие с буферным раствором, pH которого соответствует верхней границе области устойчивости исследуемого белка. В случае катионита pH буфера будет соответствовать нижней границе этой области. Обессоленный белок растворяют в соответствующем буфере, осторожно (избегая вспенивания) перемешивают с порцией ионита, отделяют надосадочную жидкость. По концентрации белка в надосадочной жидкости судят о степени связывания его с соответствующим ионообменником. [c.431]

Движение подвижной фазы в тонкослойной хроматографии может быть ступенчатым, прерывным или непрерывным. Тонкослойную хроматографию можно комбинировать с тонкослойным электрофорезом, тонкослойным изоэлектрическим фокусированием, тонкослойной гель-фильтрацией и т. д. [c.6]

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ (ФОКУСИРОВАНИЕ) [c.318]

Прежде чем приступить к изложению основ изоэлектрического фокусирования, необходимо разъяснить значение некоторых терминов. [c.297]

На протяжении всей главы наряду с понятием электрофокусирование будет использоваться термин изоэлектрическое фокусирование . Для этой цели применяли и множество других терминов изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое конденсирование, стационарный электролиз, непрерывный электролиз, изоэлектрический равновесный электрофорез. [c.298]

Следует особо указать на различие между изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом. Спектр подвижности , создаваемый с помощью электрофореза, представляет собой картину распределения белков по величине молекул и суммарному заряду при данном значении pH. Существенное преимущество изоэлектрического фокусирования по сравнению с другими методами фракционирования состоит в том, что в ходе разделения зона белка сжимается, поскольку действующие силы стремятся уменьшить размывание зон вследствие диффузии. [c.299]

Методы создания градиента pH подразделяются [9] на создание искусственного и естественного градиента. Искусственный градиент pH возникает при постепенном перемешивании наслоенных друг на друга двух буферных растворов, различающихся как по плотности, так и по величине pH. Однако при подаче на такую систему напряжения ионы начинают мигрировать, что приводит к быстрому смещению градиента. Ввиду нестабильности в электрическом поле искусственный градиент pH непригоден для изоэлектрического фокусирования в течение длительного времени. Все же Колин [8, 10] использовал искусственный градиент pH для изоэлектрического фракционирования гемоглобина, каталазы и цитохрома с. Факт разделения он зарегистрировал через 4 мин после начала электролиза прямой фотосъемкой, однако такой процесс не мог продолжаться более длительное время. [c.300]

Напряжения, рекомендуемые для изоэлектрического фокусирования [37] [c.321]

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.323]

Электрофоретическое оборудование обычно работает во влажной атмосфере, причем величины напряжения и силы тока, как правило, превышают безопасные пределы. Неправильное обращение с приборами уже привело к нескольким несчастным случаям со смертельным исходом. Омическое сопротивление человеческого тела, обычно составляющее 10 —10" Ом, существенно зависит от физиологического состояния человека и влажности кожи. Для человека опасен даже ток силой 10 мА, так как при поражении током пострадавший обычно не может сам отсоединиться от проводника. Ток силой более 25 мА вызывает серьезные повреждения в организме —остановку сердца, паралич дыхательных мышц, ожоги и т. д., которые могут привести к смерти. Учитывая, что сопротивление тела 10 Ом, напряжение всего лишь в 100 В способно привести к несчастному случаю в результате уменьшения сопротивления вследствие шока, сопровождающегося потоотделением и (или) повреждением кожи, опасно даже меньшее напряжение. Таким образом, приборы для электрофореза и изоэлектрического фокусирования, являющиеся источниками электрического тока, могут представлять опасность для жизни. Если источники питания стабилизованы, то опасность возрастает, так как напряжение во время разъединения проводов или разрыва проводящих соединений в электрофоретической камере увеличивается. При работе на приборе для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле, который обычно снабжен стабилизованным источником питания, риск часто недооценивают. [c.327]

Мало того, в ходе элюции будет шропсходить сужение белковых зон, подобно тому как это происходит при изоэлектрическом фокусировании. Действительно, белки пз иередней части зоны конечной ширины раньше всего окажутся в области щелочных pH, диктующих замедление их движения и сорбцию на новом участке колонки. В это время белки, мигрирующие из задней части зоны того же бел- [c.331]

Электрофорез (электрофорез без носителя, электрофорез на носителе гель-электрофорез, диск-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, изотахоэлектрофорез, иммуноэлектрофорез ) Ионообменная хроматография Аффинная хроматография [c.347]

Изоэлектрическое фокусирование [42 — 45] в линейном градиенте pH позволяет разделить белки, характеризующиеся различными изоэлектрическими точками. Для создания градиента используют носители с цвнттер-ионными свойствами — алифатические полиаминополикарбоновые кислоты, имеющие М 200 — 700. При движении в градиенте pH суммарный заряд белка постоянно меняется, и в области pH, близких к изоэлектрической точке, становится равным нулю. Соответствующий белок фокусируется , образуя узкую зону. При препаративном фокусировании в колонке стабилизация градиента pH осуществляется с помощью градиента плотности используемого буферного раствора, однако чаще работают с плоскими слоями полиакриламидного или гранулированного геля. Опубликовано краткое сообщение о непрерьтном электрофокусировании без носителя [46]. Эффективность электрофокусирования высока. Так, возможно, например, разделить белки, различающиеся по ИЭТ лишь на 0,01 единицы pH. При разделении сыворотки образуется более 40 белковых полос. [c.351]

Амфолит, или амфотерный электролит, — это соединение, обладающее как кислотными, так и основными свойствами. В зависимости от pH среды его суммарный заряд принимает отрицательное, нулевое или положительное значение. С помощью изоэлектрического фокусирования можно фракционировать лишь вещества с амфотерными свойствами. Белки представляют собой наиболее подходящие объекты для изоэлектрического фокусирования. Для этой цели пригодны также многие низкомолекулярные природные соединения. Для создания естественного градиента pH используют преимущественно вещества с амфотерными свойствами. В дальнейшем мы будем называть их амфоли-тами-носителями в отличие от них компоненты разделяемых смесей получат название амфолиты-образцы. [c.298]

Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и pH. Градиент pH достигают прибавлением ам.-фолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлект-рических точек (р1). В результате в колонке создается градиент pH от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его р1. [c.145]

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусировання-изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом pH. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении pH равен нулю. При использовании [c.31]

При изучении субъединичных белков и нуклеопротеидов аффинная модификация дает возможность понять, какие субъединицы участвуют в узнавании специфических лигандов. Эта проблема существенно проще, чем точная локализация точек модификации. Субъединицы как белков, так и нуклеиновых кислот обычно идентифицируются в соответствии с их положе1шем на хроматограмме, электрофореграмме, при изоэлектрическом фокусировании в зависимости от выбранной системы деления. Присоединение метки обычно не изменяет существ венно положение макромолекулы в таких системах. Следовательно, проблема заключается в том, чтобы обнаружить среди разделенных субъединиц ту, которая содержит введенную метку. Трудности возникают в тех случаях, когда в качестве лиганда, несущего реакционноспособную группу, берется полимер. Например, при изучении локализации транспортных РНК на рибосомах или на субъединицах аминоацил-тРНК-синтетаз возможно использование реакционноспособных производных тРНК. Присоединение молекул, несущих большой отрицательный заряд, может привести к сильному изменению положения модифицированного белка в используемой системе разделения. Следовательно, прежде чем проводить разделение, необходимо удалить специфическую макромолекулярную часть из модифицированного материала без разрушения связи метки с соответствующей субъединицей. [c.333]

Ригетти П. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ. ТЕОРИЯ, МЕТОДЫ И ПРИМЕНЕНИЕ. Пер. с англ., 26 л., 4 р. 20 к. [c.735]

Величины О и йи1й рН) отражают свойства разделяемого вещества. Из уравнений (2) и (3) следует, что узкие зоны должны получаться при фракционировании веществ с низкими коэффициентами диффузии и крутым подъемом кривой подвижности вблизи изоточки. Именно эти свойства характерны для белков, что делает их наиболее удобными объектами изоэлектрического фокусирования. Кроме того, вполне очевидно, что для достижения хорошего разрешения необходимо использовать высокое напряжение и пологий градиент pH. В соответствии с этим при конструировании прибора необходимо предусмотреть отвод тепла, а также возможность создания пологого и стабильного градиента pH в среде, обладающей хорошей проводимостью. [c.300]

И стабилизируется под воздействием электрического поля и, следовательно, более приюден для изоэлектрического фокусирования. Наиболее простым примером такого градиента служит электролиз обычного солевого раствора в среде, свободной от конвекции. По мере электролиза кислота концентрируется вблизи анода, а основание — около катода. В результате образуется крутой градиент с возрастанием pH от анода к катоду. [c.301]

Только при электрофорезе с подвижной границей и при зонном электрофорезе наблюдается постоянство pH во всей среде и постоянно расходящееся движение компонентов исследуемой смеси. Изоэлектрическое фокусирование может приводить к максимальным величинам pH при нулевой результирующей подвижности разделяемых компонентов. В условиях изотахрфореза [c.281]

В изоэлектрическом фракционировании, или фокусировании, сокращенно ИФ) используется градиент концентрации ионов, который влияет на заряд разделяемых компонентов, например Н+ и комплексообразующих ионов. Самый обычный пример — ИФ амфотерных макромолекул, главным образом белков при градиентном изменении pH. Белки значительно различаются по своим изоэлектрическим точкам, т. е. по значениям pH, при которых они имеют нулевой заряд. При pH меньшем, чем изоэлек-трическая точка, белок приобретает положительный заряд, и поэтому движется в электрическом поле как катион. При наличии градиента pH, который увеличивается от анода к катоду, ион движется к точке, у которой он потеряет свой положительный заряд или станет полностью электрически нейтральным. Такой градиент pH можно создать с помощью системы буферных растворов. Однако описанный метод не нашел широкого применения. Свенсон [95] теоретически обосновал и подтвердил практически преимущества применения устойчивого естественного градиента pH. Градиент такого типа наблюдается при электролизе смеси амфотерных веществ. Стационарное состояние устанавливается в том случае, когда амфолиты располагаются в порядке увеличения изоэлектрической точки р1 от самого низкого значения (вблизи анода) до самого высокого (вблизи катода). Практическое использование этого метода возможно при подборе подходящей смеси амфолитов-носителей. Амфолиты долж- [c.318]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология