Центрифугирование в градиенте плотности равновесное

Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса [13]. [c.148]

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы, и метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия. В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором — градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента. [c.417]

При достаточно большом времени центрифугирования частицы достигают в градиенте плотности равновесных положений. Именно та-[ким образом в соответствии с их плотностью в градиенте сахарозы разделяют клеточные органеллы (гл. 1, разд. Б.6). Макромолекулы (на- [c.163]

Наиболее распространенный способ создания градиента плотности — центрифугирование р-ра полимера в смеси двух или более жидкостей, отличающихся по плотности, мол. массам или по обоим показателям. Полимер собирается в области, где плотность р-ра р близка к плотности полимера в р-ре, т. е. 11 где — кажущийся парциальный уд. объем полимера в смеси растворителей. Характер распределения с х) в равновесном градиенте плотности может указывать на гетерогенность полимера по мол. массе или по плотности при определении с х) необходим учет эффекта гидростатич. сжатия. [c.200]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия является исключительно чувствительным методом для [c.577]

Затем нужно указать, что градиент плотности не известен точно, если не известны термодинамические свойства смеси растворителей здесь опять-таки нужно учитывать влияние давления. Правда, распределение плотности в ячейке может быть в принципе оценено измерениями равновесных положений маленьких частичек известной плотности, но, по-видимому, практическая применимость этого метода сильно ограничена избирательной сорбцией на поверхности частичек. При исследовании распределения по молекулярным весам и соотношения между различными видами средних молекулярных весов в смеси полимер-гомологов неопределенность в величине плотности не играет роли, но влияет на абсолютную величину получаемого молекулярного веса. Дальнейшее развитие метода центрифугирования в градиенте плотности может заключаться также и в совершенствовании техники эксперимента. Например, по-видимому, целесообразнее использовать при центрифугировании ячейки с большей длиной столбика жидкости, особенно в опытах по изучению гетерогенности полимеров. Преимуществом длинных ячеек являются возможности исследования полимеров с меньшими молекулярными весами и с большей неоднородностью по составу и работа с меньшими градиентами плотностей при изучении высокомолекулярных соединений. Одновременно с увеличением длины ячейки должна быть усовершенствована оптическая система, чтобы охватить всю длину столбика жидкости. [c.444]

Таким образом, принимая эту эмпирическую формулу, можно установить нуклеотидный состав неизвестных образцов ДНК с помощью определения их плотности р при равновесном центрифугировании в градиенте плотности. Преимущество этого метода не только в том, что он требует значи- [c.197]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности [c.149]

Рассмотрение принципов, лежащих в основе равновесного распределения в гравитационном поле, привело Сведберга к убеждению, что этот метод можно использовать для определения молекулярного веса макромолекул, если бы экспериментатор имел в своем распоряжении гравитационные поля порядка 10 —10 д. Создание таких полей стало возможным после разработки в Упсальской лаборатории ультрацентрифуги, и к 1926 г. она была использована для определения молекулярного веса гемоглобина [446, 447] и яичного белка [448]. Популярность этого метода в течение двух следующих десятилетий медленно снижалась в основном вследствие того, что для достаточно близкого приближения к равновесным условиям необходимо длительное время. Однако в последние годы значение равновесного центрифугирования опять повысилось благодаря нескольким факторам. Ряд усовершенствований конструкции прибора и экспериментальных методов привел к значительному расширению применения этого метода для прецизионных измерений [449, 450]. Полагали, что использование 0-растворителей позволит надежно оценить всю функцию распределения по молекулярным весам образцов полидисперсных полимеров по сравнению с ограниченной характеристикой средних значений молекулярного веса таких материалов другими методами. В то же время были разработаны конструкции кювет и экспериментальные методы, которые позволили производить наблюдения за столбиками жидкости высотой 1 мм или менее, что сократило время, необходимое для близкого приближения к равновесию, от нескольких суток до 1 час [451, 452]. Наконец, разработка метода центрифугирования в градиенте плотности позволила исследовать распределение по химическому составу этот способ нашел эффективное применение для изучения биологически важных макромолекул и обещает приобрести равное значение при исследовании синтетических полимеров. [c.157]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности в ряде случаев применяли при работе с белками, но ббльшая часть полученных данных относится к нуклеиновым кислотам. В гл. 22 приведены примеры применения этого метода. [c.265]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

При равновесном центрифугировании в градиенте плотности s l препаратов ДНК многих животных и растений было обнаружено присутствие наряду с основным пиком ДНК небольшого пика спутника 8 В ряде случаев было доказано, что возникновение спутника связано с присутствием в препарате внеядерной ДНК (см. ниже). В других случаях, прежде всего в ДНК из тканей млекопитающих, показано, что ДНК- спутник локализована в клеточном ядре. Наиболее изучены два представителя таких полинуклеотидов ДНК- спутник из печени мышей и ДНК- спутник из тканей некоторых видов крабов Их количество составляет от 10 до 30% общего количества ДНК клеточного ядра мол, вес. ДНК- спутника мышей найден равным 40 10 . Эти полинуклеотиды существуют в виде двухцепочечных комплексов характерным их свойством является легкая ренатурируемость, т. е. способность двухцепочечного комплекса восстанавливаться после разрушения. [c.34]

Для выделения ДНК из хлоропластов используют тот же самый прием, что и при выделении митохондриальной ДНК, — обработку субклеточных частиц ДНК-азой перед их разрушением. В этом случае, однако, не удается добиться полного удаления ядерной ДНК, и ДНК хлоропластов очищают далее равновесным центрифугированием в градиенте плотности s l. Наиболее подробному исследованию подвергалась ДНК из хлоропластов зеленой водоросли Euglena gra ilis она отличается от ДНК ядра по составу оснований и существует в виде двухцепочечного комплекса с мол. весом 10 10 . [c.35]

В принципе, реальные эксперименты можно вести при фиксированном (или исключенном) времени, но переменной координате, или при фиксированной координате, но переменном времени. Возможность подобной перестановки координата время — отличительный признак истинно транспортных методов однако, в некоторых вариантах использования ультрацентрифуг или электрофореза получаются равновесные, неподвижные кривые распределения концентрации ( полосы ), например, при изоэлект-рической фокусировке, зонном и скоростном центрифугировании в градиенте плотности и т. п. [c.4]

Центрифугирование в градиенте плотности, предложенное Ме-сельсоном [60], — ценный метод исследования природных и синтетических полимеров, основанный на различии в плотностях или скоростях седиментации его используют для разделения компонентов смеси полимеров на дискретные зоны (зонное центрифугирование). Например, сошлемся на развитие методики изучения равновесного центрифугирования в капиллярах [61 ]. [c.30]

Непреформированный равновесный градиент плотности. В этом случае и растворитель, и растворенное вещество сначала распределены равномерно по всему объему пробирки. После центрифугирования в течение некоторого времени концентрация солей растворителя (например, s l) становится различной по высоте пробирки в соответствии с седиментационным равновесным распределением, в результате чего создается градиент плотности. Исследуемые макромолекулы собираются в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. [c.182]

Центрифугирование в градиенте плотности основано на том же принципе. Как и в вышеуказанном случае, градиент плотности создается градиентом концентрации. В колонке градиент концентрации достигается тем, что слои с различной концентрацией помещают друг над другом, после чего начинается медленная диффузия, постепенно выравнивающая градиент. Роль сил тяготения сводится главным образом к стабилизации системы путем снижения до минимума конвекционных токов. Наоборот, при центрифугировании в градиенте плотности градиент концентрации является результатом сил, действующих в центрифуге, и достигает равновесного значения. Установленный таким образом градиент плотности достаточно стабилен. Этот эффект был использован Пикельсом [2] для снижения конвекции в опытах по центрифугированию. Такой же принцип применяли Калер и Ллойд [31 в своих опытах с так называемой стабилизированной движущейся границей в препаративной ультрацентрифуге. Другим применением градиента плотности является зонное центрифугирование —методика, разработанная Брекке [4], которая позволяет разделять компоненты смеси полимеров на дискретные зоны. Предварительно создают градиент плотности, так что ни в одной точке плотность не превышает плотности любого из компонентов исследуемого образца, раствор которого помещают сверху, а затем подвергают центрифугированию. Различные компоненты мигрируют в разные зоны, которые все более и более разделяются по мере центрифугирования. Еще до того, как движущаяся с наибольшей скоростьЕо зона достигнет дна кюветы, центрифугу останавливают и анализируют различные зоны. Очевидно, что метод основан на различиях в скоростях седиментации. Градиенту плотности принадлежит второстепенная ролы стабилизация системы и влияние плотности жидкости на скорость седиментации. [c.418]

Введение Мезельсоном и др. [461] метода центрифугирования в градиенте плотности позволило использовать равновесное центрифугирование для ряда новых проблем, многие из которых не могли быть исследованы любыми другими доступными в то время методами. Обзор теоретического обоснования и применения этого метода для решения биохимических проблем был опубликован Виноградом и Херстом [462]. Обзор Германса и Энде [463] посвящен в основном приложению этого метода к синтетическим полимерам. [c.163]

На осях ординат, соответствующих верху и дну центрифужной ячейке высотой I см, напоитненной 6 М С5С1, отложена плотность раствора па расстояниях от оси вращения, указанных на оси абсцисс. Три линии на этом графике показывают изменение плотности раствора после центрифугировании в течение 0 3 и 30 ч соответственно. Плотность, устанавливающуюся при 30-часовом центрифугировании, считают обычно равновесным градиентом плотности. Молекулы ДНК плотностью 1, 70 г/см должны собираться в полосе, расположенной точно посередине центрифужной пробирки. [c.193]

Равновесное центрифугирование потомства фага в градиенте плотности концентрированного раствора s l. Тяжел1-1И > фаг дикого типа (меченный N) скрещивают с лег- [c.300]

Замещение иссеченных нуклеотидов, окружающих тиминовый димер, происходит за счет репарационной репликации. За этим процессом можно проследить, поставив опыт по распределению вещества при репликации (фиг. 97) с облученными ультрафиолетом клетками Е. соН Thy . Для этого культуру облученных ультрафиолетом бактерий выдерживают разное время в присутствии меченного радиоактивным атомом бромурацила (БУ). При этом на место тимина в реплицирующуюся ДНК происходит включение более плотного БУ. Затем для измерения плотности молекул ДНК, включивших радиоактивный БУ, выделенную из бактерий ДНК подвергают равновесному центрифугированию в градиенте плотности s l. Оказалось, что бромурацил обнаруживается лишь в тех молекулах ДНК, плотность которых не отличается от плотности обычной легкой ДНК. Таким образом, в отличие от обычной репликации, которая, как это показано в гл. IX, происходит только в одной репликационной Y-вилке, репарационная репликация происходит во многих различных точках генома. Действительно, в этом случае БУ явно включился в большое число коротких полинуклеотидных сегментов, окруженных длинными участками неренлицировавшихся полинуклеотидных ценей, так что небольшое количество отдельных остатков БУ не оказывает какого-либо заметного влияния на плотность ДНК. [c.375]

Плотность сухого и сырого вещества оценивают с помощью равновесного центрифугирования в градиенте плотности (разд. 5.2.3). Однако использование этого метода для клеток, а не для субклеточного материала сопряжено со скрытыми трудностями. При определении таким способом плотности сырого вещества гидратированных клеток (например, в растворах метризамида и ренографина) активность воды и осмотическая сила имеют по ходу градиента разные значения к тому же градиентный раствор может проникать в водное пространство матрикса клеточной стенки. При определении [c.237]

Для субклонирования используется векторная плазмида рВК322. Этот вектор является Атр Те1 Выделяют ДНК этой плазмиды и проводят ее очистку равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти- [c.52]

Главный вопрос — как различать исходные молекулы ДНК и молекулы-потомки — был решен благодаря привлечению нового в то время для биологии метода — равновесного центрифугирования в градиенте плотности s l. При этом для мечения вновь синтезируемых молекул была использована утяжеляющая (плотностная) метка — изотоп азота N. [c.123]

В хлоропластах высших растений и водорослей обнаружена ДНК. Из клеток фотосинтезирующего простейшего Euglena gra ilis выделена кольцевая молекула хлоропластной ДНК, которая, судя по ее длине, имеет молекулярную массу 8,3 X Ю Д (около 126 тыс. п. н.). Плотность этой ДНК, равная 1,685 г/см , отличается от плотности ядерной ДНК (1,707 г/см ), благодаря чему ее можно идентифицировать в качестве отдельного пика при равновесном центрифугировании в градиенте плотности. Этот пик отсут- [c.229]

При скоростях ротора, много меньших, чем те, при которых проводят опыты по скоростной седиментации, в результате центрифугирования устанавливается равновесное распределение макромолекул. Форма этого распределения самым тесным образом связана с молекулярной массой и не зависит от фрикционных свойств молекулы. При наличии смеси компонентов с помощью равновесного центрифугирования получают средневесовое значение молекулярной массы. В ряде случаев можно проанализировать равновесное распределение взаимодействующих макромолекул и определить константу связывания. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является чрезвычайно эффектив- [c.265]

Было бы утомительно проводить серию электрофоретических опытов при различных близких друг к другу значениях pH. Разумной альтернативой такой постановки опыта служит электрофорез в градиенте pH. Этот вариант метода, называемый изоэлектриче-ским фокусированием, является прямым аналогом равновесного центрифугирования в градиенте плотности. Молекулы, несущие и положительные и отрицательные заряды, называют амфолитами к ним относятся, например, полимеры, содержащие многочисленные амино- и карбоксильные группы. Смесь амфолитов с широким спектром изоэлек-трических точек вводят в колонку и ожидают, пока она не распределится по колонке под действием электрического поля. Таким способом достигается стабилизация градиента pH, в котором каждый конкретный амфолит оказывается около своей изоэлектрической точки. Для того чтобы избежать потерь биологического материала на аноде или катоде, на обоих концах градиента устанавливают такие значения pH, при которых у биологических материалов не может быть изоэлектрических точек. Чтобы подавить конвекцию, градиент pH создают в твердотельном носителе. В эту систему добавляют небольшое количество белка. Он мигрирует, пока не достигнет pH, соответствующего его изоэлектрической точке. Там он и концентрируется, образуя узкую зону. Чтобы проанализировать результаты такого опыта, можно просканировать гель и измерить поглощение белка можно также окрасить белок либо нарезать гель на тонкие слои и измерить в каждом слое pH, содержание белка, ферментативную активность или радиоактивность. [c.302]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология