Клеточная трансформация, векторы

А. Векторы для клеточной трансформации [c.75]

Векторы, используемые для клеточной трансформации, представляют собой плазмиды, которые помимо участка начала репликации содержат один ген резистентности, применяющийся для селекции в клетках прокариот, и второй ген резистентности, который может использоваться для селекции в эукариотических клетках. Такие векторы имеют также несколько сайтов рестрикции, по которым и проводят клонирование нужного гена. Ряд векторов, обладающих этими свойствами, показан на рис. 4-1. [c.75]

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержашую культуру Е. соИ. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране Е. соИ быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией. [c.223]

Трансформация протопластов ОМОТ-векторами с помощью какого-либо из методов, перечисленных в разд. 3.1.2, может быть предпринята по отношению к любому виду растений, для которого разработана система протопластов. Однако даже в этом случае, если жизнеспособные протопласты, способные к формированию клеточной стенки и делению, можно получить в достаточных количествах, у многих культурных видов такие клетки не являются тотипотентными. Таким образом, кроме работ по временной экспрессии, трансформация протопластов с помощью ВМОТ-векторов в действительности не вышла за пределы круга видов, чувствительных к агробактериям. Кроме того, существуют и значительные основания предполагать, что прохождение клеток через стадию недифференцированной культуры тканей тоже способно привести к изменениям генотипа растения. По этим двум причинам многие лаборатории в настоящее время разрабатывают методы трансформации, которые не нарушают нормальное развитие и клеточный цикл растения. [c.201]

С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные растения или клеточные линии некоторых видов растений. К йх числу относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами [38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген (npt-ll), который ранее успешно применяли в экспериментах по пере носу генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при использовании методов электропорации частота трансформированных колоний может достигать 2%. что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при иС пользовании ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с нормальными менделевскими соотношениями. [c.216]

На основании результатов экспериментов по введению онкогенов в составе плазмидных векторов в первичные эмбриональные фибробласты крысы было впервые сформулировано представление о том, что для полной морфологической трансформации нормальных клеток требуется кооперация онкогенов по крайней мере двух типов. Один из них должен принадлежать к онкогенам ядерного типа, т. е. к онкогенам, продукт которых локализован в ядре и взаимодействует либо с ДНК ядра, либо с ядерным матриксом. К онкогенам ядерного типа относятся с-тус, с-туЬ, с-тИ, имеющие аналоги среди ретровирусных трансформирующих последовательностей, и белок р-53 клеточного происхождения, аналогов которого у ретровирусов нет. В группу онкогенов неядерного типа попадает большой класс онкогенов, кодирующих тирозинзависимые протеинкиназы — с.- агс, .- 68, -fgr, с-уез, с-гоз, с-аЫ группа онкогенов, кодирующая рецепторы для ростовых факторов (с-егЬ-В, с.-1т8), и сами ростовые факторы с.-з18, В-1ут1) онкогены семейства с-га5, кодирующие ГТФ-связывающие белки. Выделяют также группу онкогенов, которые к настоящему времени слабо охарактеризованы — с-за, Т-1ут/, с-ге1. [c.226]

В отсутствие специфического вектора прямая трансформация по крайней мере некоторых растительных клеток осуществляется с помощью трансфекции фрагментами чужеродной ДНК, добавленными в культуральную среду. Как и клетки животных, клетки растений поглощают ДНК и она ин-тефирует с клеточным геномом, в результате чего образуются стабильно трансформированные клетки. Однако эффективность прямой трансформации весьма низка. Отобрать трансформанты, появляющиеся с частотой примерно 1 на 10 обработанных клеток, можно лищь с помощью высокочувствительных методов. Для повыщения эффективности прямого введения ДНК в клетки растений можно использовать метод электропорации. В этом случае трансформированными становятся до 1% клеток, а кроме того, такой способ можно применять в случае как однодольных, так и двудольных растений. С помощью рекомбинантных ДНК были трансформированы различные растительные клетки, в том числе клетки табака, петуньи, томатов и подсолнечника. Для трансформации часто используют протопласты, полученные путем разрущения жестких клеточных стенок с помощью целлюлазы, в результате чего клетки становятся проницаемыми для ДНК. При переносе трансфицированных протопластов в соответствующую среду клеточная стенка восстанавливается. [c.273]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология