Селективный маркер доминантный

Ген функционирует как доминантный селективный маркер в клетках многих типов. [c.242]

Одним из ограничений рассмотренной векторной системы следует признать то, что селективным маркером является фенотип онкогенно трансформированных клеток. Только линии клеток, чувствительные к трансформации, обусловливаемой вирусом папилломы быка, являются подходящими реципиентами для сегментов чужеродной ДНК, объединенных с трансформирующей областью BPV-1. Соединение доминантных селективных маркеров с ДНК вируса папилломы позволяет расширить круг хозяев для этой векторной системы. [c.370]

Более совершенным является подход, основанный на встройке в вирусный геном доминантного селективного маркера одновременно с целевым геном. При этом встройка может происходить в любом несущественном для жиз- [c.393]

Кроме целевого гена в геном гибридного ретровируса встраивают селективный маркер преимущественно доминантного типа. Это намного упрощает отбор клонов клеток, содержащих интегрированную ДНК гибридных ретро-вирусов. Наиболее часто таким маркером служит ген пео, так как селекция в данном случае (устойчивость к антибиотику G-418) проста [c.406]

Можно также использовать амплифицируемый ген как доминантный селективный маркер при трансфекции клеток, способных синтезировать соответствуюш,ий эндогенный фермент. В этих случаях подбирают такую концентрацию токсического веш,ества, которая убивает родительские клетки, но не летальна для трансфицированных клеток из-за повышенного уровня экспрессии фермента. Не все доминантные селективные маркеры можно амплифицировать путем селекции так, бактериальные маркеры neo и gpt (см. гл. 6 книги II данной серии [34]) не удается использовать для селекции на амплификацию, так как для них нет ингибиторов, способных стехиометрически связываться с этими ферментами. Отметим, что все гены животных, перечисленные в табл. 8.1, относятся, по крайней мере потенциально, к доминантным амплифицируемым маркерам. [c.242]

Через 1—2 дня добавляют необходимую селективную среду (в зависимости от того, какой из доминантных маркеров был использован). Трансформанты фибробластов можно видеть примерно через 7 дней после добавления ДНК. Их изолируют [при наличии достаточного количества клеток (от 100 до 1000)] с помощью цилиндров для клонирования (отрезки стеклянной трубки с размерами 2x1 см). Можно также наращивать трансформанты в большом количестве и далее подвергать их скринингу на нужный фенотип. [c.42]

Чтобы избавиться от такой многоступенчатости, в той же лаборатории разработали иной подход к получению и селекции рекомбинантных вирусов осповакцины, который оказался очень удобным и универсальным для введения инсерций, делеций или мутаций в любую область вирусного генома. В данном случае доминантный маркер gpt находится в гибридной плазмиде вне фрагмента вирусной ДНК, и поэтому он может включиться в вирусный геном только в результате одиночного кроссинговера (рис. 14.33), при котором интегрируется вся гибридная плазмида, а не только вирусный сегмент. (Интеграция из плазмиды чистого вирусного фрагмента является результатом двойного кроссинговера.) Структура генома рекомбинантного вируса, в который встроена вся плазмида, нестабильна из-за наличия протяженных тандемных повторов (например tk или tku см. рис. 14.33), и при снятии селективного давления по гену gpt в результате внутримолекулярной рекомбинации плазмидная часть с геном gpt исключается с высокой эффективностью, а чужеродный целевой ген или вводимое мутационное изменение сохраняется в составе стабильного варианта VA . Этот метод получил название временной доминантной селекции. Используя данный метод, в лаборатории [c.394]

Для идентификации трансформированных клеток необходимо уметь обнаруживать чужеродную ДНК, интегрировавшую в геномную ДНК растения. Более того, при исследовании сигналов регуляции транскрипции и их функций в специфических растительных тканях (листьях, корнях или цветках) зачастую важно уметь количественно оценивать уровень экспрессии гена, кодирующего легко идентифицируемый продукт. Все это требует применения репортерных генов, которые позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток, либо оценивать активность кодируемого ими фермента. Было протестировано несколько разных генов, которые можно использовать как доминантные селективные маркеры, и генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специфических методов (табл. 17.4). Поскольку многие из ренортерных генов имеют бактериальное происхождение, они были снабжены регуляторными последовательностями, обеспечивающими их экспрессию в растительных клетках. Проводя отбор по доминантному маркеру, можно получить культуру, содержащую только трансформированные клетки. Так, в присутствии канамицина выживают только клетки растений, синтезирующих активную неомицинфосфо-трансферазу. [c.381]

Выбор штамма-хозяина диктуется типом векторной плазмиды, которую предполагается использовать для трансформации хозяин должен нести мутацию в гене, копия которого б плазмиде выполняет роль селективного маркера. Так, если доминантным селективным маркером служит плазмидный ген сир1 (обеспечивающий устойчивость к ионам меди), перед исследователем открывается широкий выбор штаммов-хозяев (гаплоидных, диплоидных или даже не охарактеризованных пивных дрожжей), поскольку большинство из них чувствительно к ионам меди, а это единственное необходимое условие их пригодности для работы с данным вектором. [c.220]

Поскольку все описанные на сегодняшний день упаковывающие MLV-клетки ведут свое начало либо от линий NIH3T3 либо от линии BALB/ ЗТЗ, рекомбинантную ретровирусную ДНК в них можно легко ввести путем трансфекции, используя стандартный метод кальций-фосфатной преципитации 34]. Непродолжительная, так называемая временная (transient), трансфекция может оказаться достаточной, чтобы получить вирусный препарат с низким титром (обычно 10—Ю /мл). Однако для достижения более высоких концентраций вируса необходимы стабильно трансформированные клеточные линии, экспрессирующие доминантный селективный маркер. Такие линии позволяют получать препараты вируса с титром Ю —10 инфекционных ед./мл. Титр вирусных препаратов, полученных путем временной трансфекции, можно повысить, если использовать гибридный ретровирусный вектор, содержащий полную область ранних генов вируса полиомы такая конструкция претерпевает в упаковывающих клетках мультикопийную внехромосомную репликацию [35]. [c.288]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Функционально полноценный клонированный ген gs вводят в клетки в составе одного из двух экспрессирующих векторов , изображенных на рис. 8.4 и 8.5. Поскольку экспрессия любого из этих векторов в клетках СН0-К1 обеспечивает клеткам устойчивость к МСКс, gs-систему можно использовать в качестве доминантного селективного маркера. [c.251]

Для амплификации вектора можно пспользовать еще один ген — ada [4]. Существует дефектная по адеиозин-дезаминазе лиь ия СКО, однако векторы, экспрессирующие ген ada, могут функционировать как доминантные селективные маркеры в клетках многих типов. [c.256]

При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в MGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом (п. 2) перед преципитацией хлоридом кальция (п. 3). Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20 1 (по весу клеточная ДНК плаз-мидная ДНК). Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции. [c.25]

Следует учитывать две основные особенности маркерных генов. Во-первых, их структуру (нуклеотидную последовательность), которая определяет такие факторы, как регуляция транскрипции (конститутивная экспрессия или включение под действием определенных внешних условий или стадии развития), скорость транскрипции, стабильность транскрипта и эффективность трансляции. Во-вторых, активность продукта данного гена, который, очевидно, отвечает за доминантную экспрессию подходящего селективного фенотипа. В большинстве обычных векторов трансформации в качестве селективных маркеров используют прокариотические ферменты устойчивости к антибиотикам, которые были адаптированы с помощью генно-инженерных методов для конститутивного синтеза в растительных клетках (табл. 2.1). В некоторых экспериментах в качестве доминантных маркеров успешно использовались ферменты, обеспечивающие защиту от гербицидов. Обычно добиваются слияния кодирующей последовательности фермента с промоторами, выделенными из Т-ДНК или генома вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), на 5 -конце, а на З -конце —с сигналом полиаденилирования (тоже полученным, как правило, из какого-либо гена Т-ДНК). В качестве маркерных генов наиболее широко используют гены устойчивости к таким антибиотикам, как канамицин, G418 [8, 27], гигромицин [54] и блеомицин [28] Недавно для трансформации растительных клеток в качестве доминантных маркеров были попользованы гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, таким, как глифосат [45]. Поскольку селективные маркерные гены нормально функционируют в трансформированных [c.33]

Современные DMGT-векторы представляют собой небольшие плазмиды (см. следующий раздел), как правило содержащие множественные сайты для клонирования, гены резистентности к антибиотикам, приспособленные для функционирования в растительных клетках либо в качестве доминантных селективных маркеров, либо в экспериментах по кратковременной (транзиторной) экспрессии, и, кроме того, прокариотические гены устойчивости к антибиотикам для селекции в бактериях (рнс. 3-1). С этими малыми плазмидами манипулируют in vitro, чтобы получить вектор в окончательном виде, а затем вводят [c.197]

Сначала в качестве селективных маркеров плазмид для дрожжевой системы использовали хромосомные гены S. erevisiae, обеспечивающие комплементацию ауксотрофных мутаций. Это вынуждало работать с узким кругом хорошо охарактеризованньк мутантных штаммов дрожжей. Гораздо проще и многостороннее подход, при котором создают плазмиды, детерминирующие устойчивость к антибиотикам, аналогам метаболитов, токсическим соединениям (табл. 12.2). Такие маркеры доминантны и обеспечивают селекцию трансформантов независимо от генотипа клетки-хозяина. [c.298]

Таблица 12.2. Примеры генов устойчивости к химическим соединениям, используемых в качестве доминантных селективных маркеров при молекулярном клонировании в клетках S. erevisiae

По отработанной схеме бьши сконструированы плазмиды серии pSV2, содержащие другие доминантные селективные маркеры. Напри- [c.348]

Следует отметить, что экспрессирующие векторы на основе ВРУ-1, несущие доминантные селективные маркеры, можно ввести в самые разные культуры клеток млекопитающих и отобрать трансформанты по проявлению этих биохимических маркеров. В клетках, не поддерживающих эписомное состояние генома ВРУ-1, гибридные молекулы ДНК интегрируются в хромосомы. [c.371]

Исходя из этих данных в разных лабораториях в 1985-1989 гг были сконструированы челночные плазмиды Е. соИ, содержащие oriP и ген EBNA-1 вируса Эпштейна-Барр. В качестве селективных использовали маркеры доминантного типа, прекрасно из5 енные на векторной системе pSV2 (см. 13.3.4), — гены пео, gpt, at. Оказалось, что плазмиды такого типа эф- [c.390]

В гибридный ретровирус встраиваются два чужеродных гена целевой неселектируе-мый ген и доминантный селективный маркер. При этом один ген транскрибируется с промотора векторного ретровируса, а второй — с лю- [c.406]

Векторы, несущие ген dhfr, имеют то преимущество, что провирусные последовательности можно подвергнуть амплификации путем метотрексатной селекции это позволяет повысить уровень экспрессии и титр вирусных препаратов [21]. Тем пе менее наибольшее распространение в качестве доминантных маркеров получили гены, обеспечивающие селективную лекарственную устойчивость — такие, как neo или hgr. Это объясняется тем, что они хорошо сочетаются со многими клеточными типами и не требуют специальной среды для селекции. Во всех известных конструкциях векторов для спаренных генов ген, расположенный ближе к 5 -LTR, экспрессируется в составе геномного вирусного РНК-транскрипта. Для обеспечения экспрессии более удаленного гена применяют два разных методических приема это либо экспрессия в составе отдельной субгеномной РНК, образующейся в результате сплайсинга вирусной РНК, либо использование внутреннего промотора, введенного в состав вектора. [c.281]

Смотреть страницы где упоминается термин Селективный маркер доминантный: [c.448] [c.259] [c.244] [c.244] [c.249] [c.255] [c.258] [c.259] [c.26] [c.96] [c.152] [c.200] [c.228] [c.347] [c.348] [c.370] [c.371] [c.387] [c.404] [c.300]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология