Модификации экспрессии рекомбинантных генов

Только на первый взгляд экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных и дрожжевых клетках под контролем хорошо изученных регуляторных элементов представляется простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит неэффективно из-за образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для преодоления этих и некоторых других затруднений в последнее время широко используются культивируемые клетки животных и растений. [c.174]

Выделение любого нового рекомбинантного гена, как правило, заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах, т.е. наработки в препаративном количестве полноценного в функциональном отношении рекомбинантного белка. В настоящее время имеется множество систем экспрессии рекомбинантных генов, среди которых наибольшее применение в биотехнологии находят модифицированные различным образом микроорганизмы. Поскольку такие системы не позволяют решить многих проблем, связанных с экспрессией эукариотических рекомбинантных генов, в том числе, осуществления посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков, в ряде случаев для решения этих проблем используют культивируемые клетки животных и растений. Для изучения механизмов экспрессии генов в лабораторных условиях большую пользу приносят так называемые пермеабилизованные культивируемые клетки с полупроницаемыми мембранами, что можно сделать в определенных условиях. Кроме того, незаменимыми помощниками молекулярных биологов и генетиков остаются бесклеточные белоксинтези-рующие системы, один из вариантов которых, а именно проточные системы, находит применение и в промышленном производстве пептидов. Принципы, лежащие в основе использования таких систем, будут кратко рассмотрены ниже. [c.168]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

Несмотря на определенные успехи в получении нативных рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках, эти системы экспрессии эукариотических генов в настоящее йремя еще далеки от совершенства. По-прежнему остается открытым вопрос о посттрансляционных модификациях рекомби- [c.123]

Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтеззу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттранс-ляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который интересует исследователя. Исходя из этого на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных. [c.144]

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу. [c.224]

Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов заключается в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов и создании эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промыщ-ленного синтеза соответствующего продукта, а задача биотехнологов — в обеспечении условий оптимального роста нужного рекомбинантного микроорганизма с целью получения продукта с наибольщим выходом. На заре развития молекулярной биотехнологии ученые наивно полагали, что переход от лабораторного синтеза к промышленному — это вопрос простого увеличения масштаба, т. е. условия, оптимальные для малых объемов, будут оптимальными и для больших, так что достаточно просто взять больший реактор и соответственно больший объем культуральной среды. [c.349]

Авторы книги М. Сингер и лауреат Нобелевской премии по химии Н. Берг—всемирно известные специалисты в области молекулярной биологии, одни из создателей генной инженерии, методической основы современной молекулярной биологии и генетики. Читатель найдет в книге подробные сведения о структуре и функциях ДНК, РНК, белков репликации и функционировании генома, обратной транскрипции модификациях, репарации и рекомбинации ДНК о транскрипции и трансляции мРНК в клетках про- и эукариот регуляции экспрессии генов технологии рекомбинантных ДНК. Все эти вопросы обсуждаются в первых двух частях книги. [c.5]

Кяеткы-хозяева. Для трансформации с помощью рекомбинантных ДНК и для изучения экспрессии генов чаще всего используют животные клетки, выращенные в культуре клеток (или, менее строго, культуре тканей). Подходящую среду для эффективной экспрессии многих клонированных генов, в том числе и генов млекопитающих, обеспечивают также ооциты Xenopus (гл. 7). В последние годы были разработаны методы введения клонированных последовательностей ДНК в эмбрионы животных на ранних стадиях развития и даже в зиготы млекопитающих. ДНК способна встраиваться в геном таких эмбриональных клеток, вызывая их стабильную трансформацию. Получено жизнеспособное потомство, причем в тех случаях, когда в геноме первичных половых клеток введенная ДНК стабильно сохраняется, новые генотип и фенотип наследуются в последующих поколениях по законам Менделя. В случае плацентарных млекопитающих развитие нового потомства зависит от эффективности имплантации трансформированных ранних эмбрионов в матку матери. Системы для такой модификации первичных половых клеток от [c.257]