Белки суперпродукция

Заверщение трансляции С-цистрона первыми рибосомами приводит к тому, что в системе появляются свободные молекулы белка оболочки. По мере трансляции этот белок накапливается и в будущем будет вовлечен в самосборку готовых вирусных частиц. Однако он оказался обладающим также и другой функцией он имеет сильное специфическое сродство к определенному участку MS2 РНК между С- и S-цистронами, включающему инициирующий кодон S-цистрона. Соответственно, он присоединяется к этому участку и репрессирует инициацию трансляции S-цистрона. Вероятно, репрессия происходит вследствие стабилизации лабильной вторичной структуры, показанной на рис. 11, белком оболочки фага и получающейся отсюда недоступности инициирующего кодона S-цистрона. Следовательно, через сравнительно короткое время после того, как трансляция S-цистрона была разрешена трансляцией предшествующего цистрона, происходит репрессия инициации трансляции S-цистрона вследствие накопления белкового продукта трансляции предшествующего цистрона. В этих условиях рибосомы, уже начавшие трансляцию, продолжают ее и в конце концов заканчивают синтез соответствующего количества молекул субъединиц синтетазы. Ограниченного количества этого белка достаточно, чтобы образовать активные молекулы РНК-репликазы, которые начнут репликацию MS2 РНК. В то же время репрессия дальнейшего синтеза этого белка позволяет избежать ненужной суперпродукции фермента. Белок оболочки фага, являющийся репрессором S-цистрона, [c.235]

Вероятность трансляционных ошибок для Е. соИ составляет 2 10 " -2 10 на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки определенных аминоацил-тРНК, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, вероятность включения в белковую молекулу неправильной аминокислоты вместо недостающей сильно увеличивается. Кроме того, точность трансляции еще больше снижается из-за недостатка GTP, который является необходимым компонентом корректирующего аппарата. В одной из работ было показано, что в условиях гиперпродукции фактора роста эпидермиса мыши в клетках Е. oli частота ошибочных включений аминокислот в рекомбинантный белок увеличи- [c.128]

При суперпродукции уровень экспрессии клонированного гена выражается в синтезе специфического белка в количестве не менее 2% от всех растворимых белков клетки-хозяина. В настоящее время имеются суперпродуценты, у которых количество синтезируемого специфического белка достигает 10—50% (здесь важнейшую роль играют многокопийные плазмиды, несущие встроенные гены). Генно-инженерными методами во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) был получен штамм E. oli, обладающий сверхпродукцией L-треонина (30 г/л за 40 часов ферментации). [c.446]

ВекторыpGEM. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е. соН и родственных им грамотрицательных бактерий, например. Salmonella и Serratia. Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, приспособленных, например, только для идентификации регуляторных сигналов, для суперпродукции чужеродных белков и их секреции, для секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в [c.201]

Помимо суперпродукции, повышенной гидро-фобности и неправильного образования дисульфидных связей формированию водонерастворимых конгломератов чужеродных белков в Е. со// способствуют и другие факторы, которые пока точно не известны. Однако совершенно ясно, что в нерастворимых включениях белок, по крайней мере частично, денатурирован, а для его перевода в растворимую форму требуется полная денатурация с разрушением дисульфидных связей. Для растворения белковых телец включения их обрабатывают в жестких денатурирующих условиях додецилсульфатом натрия, гуа-нидингидрохлоридом, мочевиной и т. п. с добавлением 2-меркаптоэтанола, дитиотреитола и др. Заключительным этапом очистки таких белков является их ренатурация, необходимая для получения функционально активного продукта. Удельная активность ре-натурированного генно-инженерного белка при этом часто не достигает уровня, свойственного природной форме. Получаемый таким образом препарат содержит балласт в виде измененных форм целевого белка, который может вызывать негативные эффекты при попадании в организм человека или животных. Поэтому при конструировании бактериальных штаммов — продуцентов эукариотических белков медицинского назначения необходимо стремиться к получению целевого белка в растворимом виде и не допускать его преципитации. Наиболее просто добиться высокого уровня продукции эукариотического белка без формирования телец включения можно, создавая штаммы, секретирующие этот белок в окружающую среду. Продуктивен также подход с использованием экспрессирующих векторов широкого круга хозяев и последовательным введением полученных на их основе гибридных плазмид в разные бактерии для поиска оптимальной пары. [c.284]

Таким образом, описанный подход позволяет распределить копии чужеродных генов по разным участкам дрожжевого генома. Он может оказаться перспективным при создании про-мьш1ленных штаммов дрожжей, экспрессирующих чужеродные гены. Такие штаммы должны более стабильно сохранять свойства суперпродукции чужеродного белка (за счет дозы гена), чем штаммы, несупдае многокопийные внехромосомные плазмиды. Последние, как правило, с относительно высокой частотой утрачиваются клетками, особенно при отсутствии селективного давления по маркерам плазмид. [c.298]

Дрожжевые гены наиболее просто клонировать и отбирать по функциональной комплементации мутантных клеток. Причем при внедрении клонируемых генов в многокопийные векторные плазмиды за счет повышенной дозы гена обычно наблюдается суперпродукция соответствующего дрожжевого белка (такой белок гораздо проще выделить в чистом виде и изучить его свойства). [c.311]

Важно отметить, что полиэдрин, синтезирующийся в цитоплазме клетки, транспортируется в ядро, где он кристаллизуется. Возможно, таким образом полиэдрин удаляется из внутриклеточного пула, что уменьшает негативное влияние суперпродукции данного чужеродного белка на метаболизм клетки и обусловливает его продолжительный синтез. [c.416]

Успехи экспериментов по клонированию и экспрессии чужеродных генов в составе гена полиэдрина вируса ядерного полиэдроза калифорнийской совки (табл. 15.2) демонстрируют перспективность применения данного вектора для эффективной продукции белков самого различного происхождения. В настоящее время ба-куловирусная система суперпродукции чужеродных белков является неотъемлемой частью многих генно-инженерных исследований. [c.421]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология