Дрожжевые геномы

Несцепленные гены в клетке могут подвергаться согласованной регуляции для обеспечения эффективного ответа на такие внешние факторы, как присутствие в среде гормонов, рост ткани за счет клеточной пролиферации, стрессовые факторы, типа голодания или теплового шока. Ключ к пониманию механизмов, обеспечивающих согласованную регуляцию, может быть найден при сравнении 5 -фланкирующих последовательностей согласованно регулируемых транскрипционных единиц. Примеры, приведенные в табл. 16.3, указывают на то, что для генов, подверженных согласованной регуляции, характерно наличие сходных коротких последовательностей, расположенных на различном расстоянии от точки инициации транскрипции. В ряде случаев с помощью анализа мутантов показано, что такие общие последовательности действительно необходимы для индукции. Так, в дрожжевом гене his 4 в 5 -концевой области содержатся три очень сходных по структуре повтора, которые присутствуют также в других генах биосинтеза аминокислот. Для предотвращения индукции гена в ответ на аминокислотное голодание необходима делеция всех трех повторов, которая в то же время не сказывается на обычном конститутивном уровне экспрессии гена his 4. [c.224]

Таблица 14.2. Ожидаемая и наблюдаемая частоты совместной конверсии в дрожжевом гене arg 4

Дрожжевые интегрирующиеся векторы (Yip) не содержат последовательностей ДНК, способных обеспечить функцию начала репликации в дрожжевых клетках, и, следовательно, трансформантов можно получить только в том случае, если произошла рекомбинация и плазмида интегрировалась в дрожжевой геном [6]. [c.213]

Наиболее элегантны опыты с химерными регуляторными белками, где в исследуемый ген вставляли бактериальный оператор, а ген-регулятор модифицировали таким образом, что ответственный за связывание с ДНК участок кодировался бактериальным геном-регулятором. Продукт такого гена — химерный белок-регулятор связывался с встроенным бактериальным оператором и тем не менее активно стимулировал работу дрожжевого гена. Иными словами, последовательность ДНК, с которой связывался белок-регулятор, не играла роли для его действия. Однако упомянутые выще опыты Ванга противоречат и этой гипотезе. Тем не менее сейчас это наиболее вероятная гипотеза, получающая все новые подтверждения. [c.192]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Для эффективной экспрессии чужеродных генов следует использовать сигналы инициации и терминации транскрипции собственных дрожжевых генов. На базе векторов YEp созданы специальные экспрессирующие векторы, называемые сэндвич-векторами (рис. 34). Эти векторы содержат в своем составе [c.178]

Получение из клонированного фрагмента дрожжевой ДНК С Л/11-сегмента. Сконструированный плазмидный вектор, содержащий дрожжевой ген Г/ Р1 и, 4/ 5-по-следовательность, использовали для создания геномной библиотеки. После трансфекции дрожжевых клеток /7 еМ4 и Up были отобраны колонии, растущие на среде без метионина и триптофана. Клетки из одной такой колонии содержали плазмиду с геном МЕЛ 4 [c.210]

Существование гиперчувствительных к нуклеазам свободных от нуклеосомных гистонов участков в промоторной и регуляторной областях — обязательный признак активного или потенциально активного в данных клетках гена. Отсутствие гистонов в этих участках может быть обусловлено различными механизмами. Во-первых, некоторые специфические последовательности ДНК, та-лне, как полиёА поли dT, не способны в силу некоторых причин (например, излишней жесткости) сворачиваться в нуклеосомную структуру. Такие свободные от гистонов области гомополимеров найдены, в частности, в промоторных областях некоторых дрожжевых генов, и их присутствие существенно для активного состояния этих генов. Другим механизмом может быть связывание специфических белков с регуляторными участками ДНК, что препятст- [c.256]

В ходе рекомбинации брешь застраивается по образцу второй рекомбинирующей молекулы. Например, если наблюдать рекомбинацию между введенной в дрожжевые клетки плазмидой, несущей какой-нибудь дрожжевой ген, нарушенный двуцепочечной брешью,. и таким же геном в хромосоме (рис. 63), то нарушенный плазмидный ген восстановится по образцу хромосомной копии. Эти данные позволили сформулировать модель рекомбинацнн-репарации двуцепочечного разрыва. Для этой модели характерно образование двух, а не одной, холидеевских структур. На рис. 64 представлен один из вариантов этой модели. Поскольку двуцепочечная брешь одной из рекомбинирующих молекул ДНК застраивается по образцу [c.96]

Используя температурочувствительные мутанты дрожжей, легко клонировать гены этого организма, ответственные за транспорт. Такой подход чрезвычайно плодотворен, т. к. позволяет напрямую выявить главные белки транспортного механизма, не зная даже, как происходит секреция. Один из дрожжевых генов, отвечающих за секрецию, который был выявлен таким образом - это ген se 4. Полагают, что он кодирует GTP-связывающий белок из семейства ras (см. разд. 12.3.11 и 13.4.6). Биохимические эксперименты на клетках млекопитающих свидетельствуют о ТОМ- что сходный GTP-связываюший белок участвует в везикулярном транспорте и у высщих эукариот Возможно, он регулирует раздевание неклатриновых окаймленных пузырьков перед их связыванием с мембранами. [c.84]

Рис. 10-24. Описание эксперимента, позволяющего выявить в составе белка-активатора а14 у дрожжей, независимые ДНК-связывающие и активирующие транскрипцию домены Функциональный белок-активатор может быть получен при соединении карбоксиконцевой части белка а14 и ДНК-связывающего домена бактериального белка-регулятора (белок 1ехА) методом слияния генов. Полученный таким образом бактериально-дрожжевой гибрид будет активировать транскрипцию дрожжевых генов, если перед этими генами встроить специфический сайт, необходимый для его связывания. А. Нормальная активация транскрипции белком а14. Б Химерный белок-регулятор для проявления своей активности нуждается в сайте ДНК, связывающем белок 1ехА. Аналогичные эксперименты продемонстрировали наличие отдельных доменов

В их участок, гомоличный дрожжевому геному, ввести двухцепочечный разрыв. [c.215]

Так, несмотря на то что около 10% дрожжевых генов содержат интроны, сплайсинг про-мРНК высших эукариот не осуще- [c.177]

В качестве дрожжевых репликаторов используют хромосомные репликаторы ARS (см. гл. 5) и гомологичный им репликатор 2-микроннои плазмиды (см рис. 3.18). У дрожжей селективные маркеры типа устойчивости к антибиотикам не обнаружены. Поэтому в качестве таковых стали применять дрожжевые гены, функционально активные и в клетках Е. ob, т. е. исправляющие соответствующие бактериальные дефекты (см. табл. 11.1). [c.353]

Участие РНК-посредника в транспозиции Ту-элемента получило еще более убедительное подтверждение в опытах с использованием повторно модифицированного донора Ту. В его центральный участок е был встроен интрон из неродственного дрожжевого гена вместе с короткими участками фланкирующих его жзонов. Обычно Ту-элементы не содержат интронов. Не содержал интрона и [c.254]

Важное направление исследований открывает также возможность введения мутаций в клонированные дрожжевые гены с последующей встройкой таких генов в нормальные положения генома для изучения влияния мутаций на функции генов. Такая обратная генетика имеет большое значение для тонкого молекулярно-генетического познания S. erevisiae, а также изучения организации и функционирования генетических элементов эукариот в целом. [c.286]

Дрожжевые гены наиболее просто клонировать и отбирать по функциональной комплементации мутантных клеток. Причем при внедрении клонируемых генов в многокопийные векторные плазмиды за счет повышенной дозы гена обычно наблюдается суперпродукция соответствующего дрожжевого белка (такой белок гораздо проще выделить в чистом виде и изучить его свойства). [c.311]

Таким образом, используя многокопийный молекулярный вектор с регулируемым сильным промотором, синтетический ген-эквивалент чужеродного белка, состоящий из мажорных дрожжевых кодонов и состьшованный на 5 -конце в правильной рамке трансляции с кодирующей последовательностью убиквитина, а также 3 -концевой некодирующий район како-го-либо дрожжевого гена, можно сконструировать гибридную плазмиду, которая в клетках S. erevisiae будет направлять сверхсинтез целе- [c.318]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология