Рестриктазы условия реакции

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага X при оптимальных условиях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от pH, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии. [c.27]

С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже гл. 6) часто возникает необходимость расщепления рестриктазами амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях, когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость способности [c.56]

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей липкие комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК (см. рис. 19). Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, кодируемая фагом Т4 (но не лигаза Е. oli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента. [c.141]

Основными проявлениями специфичности, характерными для всех рестриктаз, являются 1) узнаваемая последовательность нуклеотидов, 2) место расщепления и 3) зависимость действия рестриктаз от характера метилирования оснований в пределах узнаваемой последовательности. Некоторые другие функциональные проявления этих ферментов, а именно, способность надрезать одну нить гемиметилированной ДНК, расщеплять однонитевую ДНК и способность менять субстратную специфичность в сторону более низкой в зависимости от условий проведения реакции являются менее изученными и возможно присущи не всем рестриктазам. [c.33]

Обсуждая влияние сайт-специфического метилирования в неканонических положениях узнаваемого участка следует иметь ввиду, что ингибирующее действие на рестриктазы не всегда проявляется по принципу да или нет [105, 258]. Иногда наблюдается только снижение активности фермента в 5—20 раз [152, 274]. В таких случаях конечный результат может зависеть от условий проведения реакции, времени ее протекания, концентрации фермента. Возможно этим следует объяснить, например, противоречивые данные о том, что RXma I расщепляла 5 GGG последовательность в эукариотической ДНК, но не в ДНК Н. parainfluenzae [98, 415, 416]. [c.48]

Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат. [c.129]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология