Очистка рестриктаз

Для экстракции рестриктаз, расположенных в периплазматическом пространстве грамотрицательных клеток, был апробирован их осмотический шок [179, 251], что нашло применение при разработке схемы очистки рестриктазы Pst I [251]. В дальнейшем этот метод в препаративных работах по выделению рестриктаз не получил распространения, что, учитывая ограниченный выход целевых ферментов в раствор [251] и относительную трудоемкость обсуждаемой процедуры, является вполне объяснимым. [c.144]

Низкая эффективность вышеизложенных методов удаления нуклеиновых кислот в отношении очистки целевых ферментов и потенциальная возможность больших их потерь, а также некоторые методические трудности в подборе оптимальных условий проведения этих процедур послужили определенным стимулом для апробации возможности использования на этой стадии очистки рестриктаз хроматографических подходов. [c.148]

Применение хроматографических методов разделения нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз основано на использовании с этой целью их разницы в молекулярных весах, значений и величин заряда. Учитывая определенную избирательность используемых с этой целью хроматографических материалов и то, что большая часть процессов по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз осуществляется в одной стадии в колоночном режиме, следовало бы ожидать совмещения решения вышеуказанной задачи с определенной как функциональной, так и абсолютной очисткой рестриктаз от сопутствующих примесных нежелательных активностей и белков. [c.148]

Методы, используемые для очистки рестриктаз [c.154]

В 1978 г. Грин с соавт. [109] предложил методику очистки рестриктаз, включающую последовательное хроматографическое фракционирование на ФРИ и ГАП. Бесклеточный экстракт на первый сорбент наносили без предварительного удаления нуклеиновых кислот. После проведения очистки по обсуждаемой схеме в 13-ти случаев из 16-ти испытанных были получены функционально очищенные препараты исследуемых ферментов, пригодных для использования в качестве аналитических реагентов. [c.159]

Сводные данные о выходе и степени очистки рестриктаз, очищенных до гомогенного состояния [c.164]

В случае выделения гомогенного препарата рестриктазы Всп I ГС была использована для хроматографического фракционирования грубого экстракта продуцента этого фермента. В результате было достигнуто 150-ти кратное увеличение удельной активности целевого фермента, выход которого составил более 50% [196]. ГС в опытах по выделению функционально очищенных препаратов рестриктаз применяется не так уж и, часто. Приведенные выше данные, иллюстрирующие высокую эффективность этого сорбента в отношении очистки рестриктаз, убеждают о перспективности ГС для получения функционально очищенных препаратов специфических эндонуклеаз. [c.169]

Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат. [c.129]

Ранее обсуждался пример многократной очистки рестриктазы E oR I после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ [48, 263]. Скорее всего такая эффективность данной стадии в отношении очистки целевого фермента является исключением. Учитывая то, что фракционированию подвергается сложная смесь клеточных компонентов, содержащихся в грубых экстрактах, а используемые методы не являются избирательными, следует предположить, что в большинстве случаев достигается только эффективное удаление нуклеиновых кислот без сколько-нибудь значительной очистки рестриктаз. Поэтому те немногочисленные примеры работ, в которых приведены количественные данные относительно степени очистки рестриктаз обсуждаемыми способами [13, 127], не противоречащие выше указанному предположению, думается являются типичными. [c.148]

Во многие схемы очистки рестриктаз вводится стадия высаливания белков сернокислым аммонием. С применением этой процедуры решаются многие задачи очистка, концентрирование разбавленных растворов, отделение рестриктаз от СС и ПЭИ. Так Муррей с соавт, [188] подобрали условия эксперимента, позволяющие разделить на этой стадии рестриктазы Ava I и Ava П, выделяемые из одной биомассы, которые переходили в осадок при 20—40% и 50—70% насыщении бесклеточного экстракта А. variabilis сернокислым аммонием соответственно. Примером другого варианта фракционирования высаливанием является работа Модрича и Забелы [184], где была использована экстракция белкового осадка, полученного при 70% насыщении грубого экстракта Е. соИ RY13 солью, растворами со ступенчато понижающейся концентрацией сернокислого аммония. В результате проведения такой процедуры удалось повысить удельную активность целевого фермента в 2,7 раза. Фракционное высаливание белков нашло применение в схемах очистки многих рестриктаз [74, 98, 115, 118, 140, 142, 152, 173, 235, 247, 248, 296 и др.]. [c.154]

Наиболее эффективным и распространенным способом очистки является хроматографическое фракционирование. Характерной чертой использования этого приема для очистки рестриктаз является то, что решение задачи получения функционально очищенных препаратов этих ферментов достигается путем применения ограниченного круга сорбентов. Наряду с традиционными сорбентами — ДЭАЭц, ФРП, ГАП, карбоксиметилцел-люлозой и носителями для гельфильтрации для очистки специфических эндонуклеаз в настоящее время используются и сорбенты, для которых предполагается участие в связывании рестриктаз не только ионных, но и гидрофобных и аффинных взаимодействий. В отношении последних двух типов взаимодействия следует отметить, что они во многих случаях только постулированы, но не доказаны соответствующими экспериментами. Тем не менее, апробация новых сорбентов для очистки рестриктаз дала положительные результаты. [c.155]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]

Несмотря на довольно убедительные данные [102] об эффективности применения вышеуказанных сорбентов для очистки ряда рестриктаз, они практически не получили распространения в этой области препаративной биохимии ферментов. Хроматографическое фракционирование на голубой сефарозе было включено как одна из стадий очистки рестриктаз Мга I [289] fl I, Gal i и Gee i [121] и при получении гомогенных препаратов Pal I [33] и Mva I [29]. Пиран сефароза нашла применение в ходе выделения функционально очищенных Nsp рестриктаз из Nosto РСС7524 [211]. [c.157]

Хроматографическая очистка, основанная на истинной биоспецифической аффинности исключительно к выделяемому белку, достигается при использовании иммуносорбентов. В литературе описано применение такого сорбента для очистки рестриктазы E oR 1 [9]. Авторы этой работы проводили сорбцию фермента на колонке с антителами к E oR I, иммобилизованными на сефарозе 4В, непосредственно из бесклеточных экстрактов. В результате последующей элюции в одну стадию удалось получить гомогенный препарат фермента. Широкому применению иммуносорбентов препятствует то, что для иммунизации необходимо располагать гомогенными препаратами рестриктаз. [c.157]

В завершении обсуждения применения для очистки рестриктаз сорбентов, для которых или предполагается, или действительно реализуется биоспецифическая сорбция, хотелось бы обратить внимание на ФР II. В общем случае она представляет собой катионит, содержащий присоединенные к глюкозным остаткам целлюлозы фосфогруппы. В этом отношении этот сорбент в какой-то мере имитирует углеводно-фосфатный остов ДНК. Вопрос о движущей силе взаимодействия рестриктаз с этим сорбентом не исследован. Однако известные факты о сильном связывании фосфоцеллюлозой рестриктаз, являющихся кислыми белками, при значениях pH, значительно превышающих их изоточку [74, 120, 184, 196, 254] склоняют к предположению [c.157]

Примеры реализации истинной гидрофобной хроматографии в ходе очистки рестриктаз, выражающейся в десорбции ферментов, связанных при высокой иониой силе, в условиях понижения концентрации солей в элюирующих растворах, немногочисленны. [c.158]

Несмотря на общность приведенных выше схем очистки многих рестриктаз, она является в большей степени кажущейся, чем действительной. Это связано с тем, что в каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, выражающийся в подборе условий проведения той или иной стадии и выборе последовательности их применения. Вместе с тем по ходу развития работ по очистке рестриктаз выявилась тенденция создания именно унифицированных (универсальных) схем, пригодных для выделения многих рестриктаз без предварительного подбора условий проведения отдельных стадий и их последовательности. Иначе говоря, по тем или иным соображениям выбирается схема и проверяется ее пригодность для очистки ряда рестриктаз. Первыми этот подход реализовали Бикл с соавт. [43]. Их схема включала обработку бесклеточного экстракта ПЭИ в присутствии 0,1 М Na l, последующее высаливание белков 70% насыщением раствора сернокислым аммонием, диализ и хроматографическое фракционирование на ГС (градиентная элюция 0,0—1 М Na l). Применение такой процедуры, согласно утверждению авторов, позволило получить препараты большинства из 16-ти исследованных рестриктаз, по уровню функциональной чистоты пригодные для опытов по физическому картированию, а в некоторых случаях и для секвени-рования ДНК. [c.159]

К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Бекси [32], апробировавших с этой целью прямое фракционирование бесклеточных экстрактов четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Однако, эффективность этого метода была продемонстрирована на небольшой группе рестриктаз и для определения его универсальности необходимы дополнительные исследования. [c.159]

В тексте в основном шла речь о компоновке схем очистки рестриктаз, т. е. о том какие стадии и сорбенты и в какой последовательности применяются в конкретных случаях. Актуаль- [c.161]

Другой подход, заключающийся в изучении взаимодействия ферментов с сорбентами в статических условиях (в пробирке), иногда используемый при отработке схем очистки ферментов, не должен обладать перечисленными недостатками. В литературе имеется публикация, посвященная апробации этого подхода в случае разработки схем очистки рестриктаз [29]. Полученные результаты свидетельствуют, что предварительные исследования в статических условиях занимают по сравнению с колоночной хроматографией значительно меньше времени. Кроме того применение статического метода позволяет установить диапазон и характер влияния различных факторов (например, ионной силы) на связывание, что дает возможность, предсказать условия проведения колоночной хроматографии. В результате за краткое время удается апробировать ряд сорбентов, выбрать среди них наилучшие в отношении очистки и выхода целевого фермента и прогнозировать условия элюции в режиме колоночной хроматографии. Принципиальным различием между схемами разработанными путем их конструирования на основе предварительных опытов проведенных в колоночном режиме и в статических условиях является то, что в последнем случае, благодаря нетрудоемкости предварительных опытов, реальным является разработка именно оптимальных схем очистки — оптимальных в отношении спектра выбранных сорбентов, их числа и последовательности применения. [c.162]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология